【摘要】：卵黃抗體(IgY)具有成本低、特異性強、穩(wěn)定性好、口服安全等優(yōu)點,利用其制備新型α-淀粉酶抑制劑(α-AI)具有巨大的應用潛力。目前利用納米Fe_3O_4靶向治療腫瘤的研究十分廣泛,但在糖尿病靶向治療中研究甚少,將IgY偶聯(lián)于磁性Fe_3O_4納米顆粒構建具有靶向功能的IgY納米探針,可提高IgY的有效利用率。IgY屬于蛋白質(zhì),口服給藥時易受胃液降解,海藻酸鈣/殼聚糖凝膠具有低毒性、穩(wěn)定性和生物相容性,可對IgY納米探針進行包埋,使其順利到達腸道并發(fā)揮降血糖作用。首先,以豬胰α-淀粉酶為抗原免疫蛋雞,采用水稀釋法和硫酸銨兩步沉淀法提取純化可抑制α-淀粉酶的卵黃抗體(A-IgY)。電泳結(jié)果顯示,A-IgY的重鏈和輕鏈的相對分子質(zhì)量分別為65 kDa和25 kDa,糖基化修飾主要發(fā)生在重鏈部分。A-IgY的純度為92%,IgY濃度為8.51 mg/mL,提取率為18.5 mg/mL卵黃液。其次,采用Bernfeld法檢測A-IgY對α-淀粉酶的抑制效果。結(jié)果顯示:A-IgY對α-淀粉酶的抑制率自首次免疫后逐漸增加,于第10周達到最大值(98.90%),隨后基本穩(wěn)定至第17周,而N-IgY表現(xiàn)出很低的抑制活性(抑制率約7%)。A-IgY通過非競爭性方式抑制豬胰α-淀粉酶,IC_(50)值為1.189 mg/mL,對相同酶活力的人胰α-淀粉酶的抑制率為82.76%。A-IgY能有效抑制日常飲食中淀粉的分解作用(α-淀粉酶抑制率都在85%以上),與α-淀粉酶的共浴時間的增加能提高A-IgY的抑制活性,共浴90 min時抑制率接近100%。A-IgY對α-淀粉酶的抑制活性在30~40~oC和pH 6~9時最高,在模擬胃液中明顯降低,但在模擬腸液中較為穩(wěn)定。然后,將A-IgY分別偶聯(lián)于磁性Fe_3O_4@DMSA和Fe_3O_4@PEG納米顆粒上構建A-IgY納米探針。表征結(jié)果顯示:這四種納米顆粒的形貌良好,尺寸均勻,單分散性好;偶聯(lián)反應后Fe_3O_4@DMSA和Fe_3O_4@PEG納米顆粒的水動力尺寸均增加(分別由18.21nm和24.36 nm增加至51.39 nm和54.50 nm),Zeta電位均下降(分別由-36.4 mV和-25.2mV下降至-23.4 mV和-16.1 mV),偶聯(lián)反應后FT-IR圖上顯示出酰胺帶和IgY的特征吸收峰,這些結(jié)果表明A-IgY已經(jīng)成功偶聯(lián)至Fe_3O_4納米顆粒上,且A-IgY裝載率分別為68.10%和80.65%。VSM結(jié)果顯示Fe_3O_4@DMSA@IgY和Fe_3O_4@PEG@IgY納米顆粒均具有超順磁性,飽和磁化強度分別為54.08 emu/g和64.05 emu/g,兩者的對α-淀粉酶的抑制率分別為83.73%和87.35%,這表明偶聯(lián)反應并未影響A-IgY的抑制活性。最后,采用海藻酸鈣/殼聚糖凝膠為載體包埋Fe_3O_4@PEG@IgY納米顆粒。結(jié)果顯示:載Fe_3O_4@PEG@IgY凝膠珠為光滑球體,分散性好,粒度均勻,呈雙層膜結(jié)構,磁響應性良好,經(jīng)模擬胃液反應2 h后變得更緊實,A-IgY釋放率僅為6.60%,再經(jīng)腸液反應后能快速釋放出A-IgY(2 h釋放90.86%)。將凝膠珠靶向給藥于健康大鼠后進行CT成像,結(jié)果顯示凝膠珠在2 h內(nèi)進入腸道,48 h左右排除干凈。將凝膠珠灌胃于db/db大鼠后進行餐后血糖的測試,結(jié)果表明載Fe_3O_4@PEG@IgY凝膠珠的降血糖效果明顯優(yōu)于阿卡波糖,且藥效持久性更佳,有望成為新型安全的糖尿病防治藥物。
【圖文】：

IgY和IgG的結(jié)構

圖 2-1 載 Fe3O4@PEG@IgY 凝膠珠的靶向定位 2-1 Targeted positioning of Fe3O4@PEG@IgY ge常飼養(yǎng) 1 周后禁食 12 h，，灌胃載 Fe固 體永磁鐵 （ 如圖 2-1）進行粒聚集于靶向組織。24、48、72 h 時對大鼠分別進行胃影具體操作為：用灌胃針向大鼠胃），讓大鼠自由活動片刻，以使造鼠后，對大鼠的胃部和腸道進行 M察 Fe3O4@PEG@IgY 納米顆粒在大作為對照。鼠正常飼養(yǎng) 20 天后，隨機分成 3 大鼠禁食 12 h（期間自由飲水）后
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ460.6

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本文編號：2688873