【摘要】：自然界中存在兩種果聚糖,按照糖苷鍵型的差異可分為菊糖和levan型果聚糖。菊糖在一些菊科植物中含量豐富,具有許多優(yōu)異的性質(zhì)和生理功能,已被作為可溶性膳食纖維,應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等許多領(lǐng)域。目前,工業(yè)化的菊糖大多來自植物菊苣,相反,levan型果聚糖主要來自微生物,植物中含量很少。國內(nèi)尚沒有關(guān)于微生物來源菊糖的報道,實際上,一些微生物可通過菊糖蔗糖酶(Inulosucrase,EC:2.1.4.9)以蔗糖為唯一底物,一步合成菊糖。眾所周知,多糖的分子量是影響其性質(zhì)和功能的關(guān)鍵因素,而微生物菊糖與植物菊糖的主要不同在于分子量,微生物菊糖的分子量一般在10~6 g/mol以上,是植物菊糖的百倍。即使如此,微生物菊糖及菊糖蔗糖酶仍未得到足夠的重視。本課題鑒定了一種來源于乳酸菌L.gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶,并對酶學(xué)性質(zhì)和產(chǎn)物多糖的鍵型進(jìn)行鑒定。之后,對菊糖合成條件進(jìn)行優(yōu)化。最后,通過定點突變獲得了使酶活和穩(wěn)定性提高的正突變。本課題利用不同的N-端截斷方式構(gòu)建重組菊糖蔗糖酶。相應(yīng)的截斷基因插入進(jìn)載體pET-22b(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi),IPTG誘導(dǎo)重組酶的過量表達(dá)。通過檢測兩種截斷的菊糖蔗糖酶在最適pH和溫度下的活力表明:不同的N-端截斷方式僅改變了菊糖蔗糖酶的最適pH和溫度,對酶活的影響不大。酶學(xué)性質(zhì)鑒定表明,Laga-ISase(截斷信號肽、N-端的101個氨基酸和C-端)總酶活的最適pH和最適溫度分別為pH 5.5和35℃。大部分二價金屬離子對Laga-ISase酶活有促進(jìn)作用,其中Mn~(2+)可以將酶活提高至157%。熱穩(wěn)定性研究表明,45℃保溫3 h,殘余酶活仍保持為原始酶活的84%,為目前已經(jīng)鑒定的菊糖蔗糖酶中熱穩(wěn)定性最高的。結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究表明,Laga-ISase的變性溫度為55℃。對Laga-ISase的反應(yīng)動力學(xué)研究表明,該酶的總酶活和轉(zhuǎn)糖苷酶活的反應(yīng)動力學(xué)行為不遵循米氏方程。而水解酶活符合米氏方程底物飽和的典型特點,且水解酶活的K_m為44.12 mmol/L。通過傅里葉變換紅外光譜和核磁共振檢測產(chǎn)物多糖的糖苷鍵型,確定產(chǎn)物為β-(2,1)糖苷鍵連接的菊糖。以30%蔗糖為底物,對酶法合成菊糖的條件進(jìn)行優(yōu)化,獲得菊糖合成的最適加酶量和時間分別為:4.5 U/g蔗糖和1.5 h。在最適條件下,獲得的菊糖的分子量為5.86′10~6 g/mol。之后,通過分子生物學(xué)手段結(jié)合計算模擬和理性設(shè)計,獲得13個定點突變的突變體。通過對突變體酶的活力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)了對酶活和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要作用的關(guān)鍵位點。其中,Q196E的總酶活和T_m值分別降低至野生酶的37.8%和54.2℃,這表明殘基Gln196對酶的活力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用。另外,獲得了使酶活提高的正突變,突變體D288E的酶活為野生酶的131.5%。大部分突變體的T_m值增加,其中A310E、S346A、I478M和A491S的T_m值分別較野生酶提高了1.38、1.39、1.83和1.31℃。
【圖文】：

果聚糖是以果糖分子為基本組成單元，在非還原性末端有一分子葡萄糖的多糖。自然界中主要存在兩種果聚糖，分別是菊糖和levan類型果聚糖。兩者的主要差別體現(xiàn)在連接果糖基的糖苷鍵的不同。菊糖的果糖基分子間通過β-(2, 1)糖苷鍵連接（圖1-1A），而levan類型果聚糖則是通過β-(2, 6)糖苷鍵（圖1-1B）。菊糖在自然界中相對廣泛的存在于許多植物中，而levan類型果聚糖的植物來源僅限于少許草本植物中且含量極低，如：冰草和鴨茅等。很多微生物含有一種能將蔗糖轉(zhuǎn)化成levan類型果聚糖的果聚糖蔗糖酶，因此，對于levan類型果聚糖的研究主要是針對微生物來源的levan類型果聚糖。鑒于菊糖較廣泛的植物來源，對于菊糖的研究比levan類型果聚糖更加深入。圖 1-1（A）菊糖分子結(jié)構(gòu)（B）levan類型果聚糖分子結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 (A) The molecular structure of inulin (B) The molecular structure of levan-type fructan1.2 菊糖概述1.2.1 菊糖的分類及植物來源菊糖類型的果聚糖按照聚合度可分為低聚果糖（聚合度為2-10）和菊糖（聚合度大于10）[1]。本文將β-(2, 1)糖苷鍵連接的低聚果糖和菊糖統(tǒng)稱為菊糖。自然界中，菊糖存在于許多植物中

菊糖蔗糖酶有三種主要功能。其一，剪切蔗糖；其二，將果糖基轉(zhuǎn)移到另一分子蔗糖上；其三，延伸菊糖鏈。因此，當(dāng)菊糖蔗糖酶利用蔗糖為唯一底物時，會發(fā)生三種連續(xù)的反應(yīng)，如圖1-2A。首先，在菊糖蔗糖酶的作用下蔗糖被分解為一分子葡萄糖和酶-果糖基復(fù)合體中間物。其次，如果水作為果糖基受體，果糖基會從酶上釋放，發(fā)生水解反應(yīng)。相反，，如果另一分子蔗糖作為果糖基受體，會發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，生成蔗果三糖。最后，不斷延伸的低聚果糖分子不斷作為受體，發(fā)生聚合反應(yīng)，菊糖分子不斷延伸。Ozimek等發(fā)現(xiàn)，L.reuteri121菊糖蔗糖酶也具有歧化反應(yīng)的能力[38]（如圖1-2B）。因此，對應(yīng)于菊糖蔗糖酶的催化進(jìn)程，定義了三種酶活。反應(yīng)體系里葡萄糖的量與供體蔗糖一致，代表總酶活。果糖的量與參與水解反應(yīng)的蔗糖的量一致
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ929

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2 劉德蔚;含菊糖類中草藥的綜合利用[J];中成藥;1999年12期

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本文編號：2688855