發(fā)布時(shí)間：2020-05-15 19:02

【摘要】：目前利用釀酒酵母降解木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇已得到全面商業(yè)化生產(chǎn)。然而,木質(zhì)纖維素在水解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜抑制物對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)乙醇造成不利的影響。糠醛是其中主要抑制物之一,能誘導(dǎo)活性氧(ROS)的積累,各種代謝通路關(guān)鍵酶活性降低,最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性衰亡。目前主要集中在利用反向遺傳學(xué)(基因變化研究表型變化)來(lái)發(fā)現(xiàn)可能與耐受抑制劑相關(guān)響應(yīng)代謝途徑的基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,并對(duì)微生物進(jìn)行改造(過(guò)表達(dá)或敲除)來(lái)提高耐受性,但是關(guān)于酵母糠醛耐受性表型的系統(tǒng)全基因組分析還未得到驗(yàn)證及完全明確的解析,同時(shí)部分都是以實(shí)驗(yàn)菌株為研究對(duì)象,而工業(yè)釀酒酵母的遺傳結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。因此,本研究從分子生態(tài)學(xué)及正向遺傳學(xué)(從天然表型變化研究基因本質(zhì)變化)角度來(lái)深入分析釀酒酵母的糠醛耐受性機(jī)制,同時(shí)為其他纖維素抑制劑耐受性的研究提供有效可行的方法。本文以48株工業(yè)釀酒酵母為出發(fā)菌株,進(jìn)行不同濃度糠醛耐受性的表型測(cè)定,最大表型值達(dá)到21 mmol·L~(-1),最小表型值達(dá)到5 mmol·L~(-1),大部分菌株的表型值處在 15 mmol·L~(-1)~17 mmol·L~(-1)。由于工業(yè)釀酒酵母存在產(chǎn)孢能力退化問(wèn)題,選擇了表型值為21 mmol·L~(-1) CICC 31144(二倍體)作為抗性親本,11 mmol·L~(-1) CICC 1373(二倍體)作為敏感菌株。在McClary產(chǎn)孢培養(yǎng)基上進(jìn)行生孢實(shí)驗(yàn)分析兩株菌的產(chǎn)孢能力,CICC31144產(chǎn)孢率在41%±0.12%,而CICC 1373產(chǎn)孢率在55%±0.17%。利用PCR技術(shù)快速鑒定單倍體交配型并表型篩選及HO基因敲除,成功獲得表型值21 mmol·L~(-1)作為高耐糠醛菌株(CICC 31144-MAT-a)親本P1,一株表型值為11 mmol·L~(-1)作為低耐糠醛菌株(CICC 1373-MAT-α)親本P2。親本菌株雜交構(gòu)建大量子代群體用于遺傳作圖,利用SPSS 19.0軟件對(duì)200株F2代群體進(jìn)行糠醛耐受性表型分布進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析,偏度系數(shù)為㧟0.375,峰度系數(shù)為0.238,二者系數(shù)小于1,近似正態(tài)分布,說(shuō)明糠醛耐受性狀是傳統(tǒng)連續(xù)性數(shù)量性狀,并適用于數(shù)量遺傳學(xué)研究。將已有的微衛(wèi)星(SSR)位點(diǎn)(190個(gè))在兩株親本單倍體菌株間基因分型,篩選出來(lái)具有多態(tài)性的位點(diǎn)共82個(gè),多態(tài)性比例在43%。利用這些多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)分布在兩極端F2代群體(39株)基因分型并進(jìn)行基因型均值差異分析,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與糠醛耐受性相關(guān)微衛(wèi)星位點(diǎn),其中2P3位點(diǎn)達(dá)到顯著差異,而2P5位點(diǎn)達(dá)到極顯著差異,耐受親本P1的2P5基因型(333 bp)在子代耐受群體中出現(xiàn)率為72.2%,而敏感親本P2的基因型(318 bp)在子代敏感群體中出現(xiàn)率達(dá)100%(333 bp出現(xiàn)率為零),說(shuō)明2P5位點(diǎn)可能與控制該性狀的QTL具有極顯著連鎖遺傳關(guān)系。利用Kosambi函數(shù)構(gòu)建遺傳圖譜,79個(gè)總標(biāo)記數(shù),14個(gè)連鎖群,總長(zhǎng)度1499.07 cM。利用完備區(qū)間作圖(ICIM)對(duì)糠醛耐受性數(shù)量性狀定位,LOD曲線在2號(hào)、7號(hào)、16號(hào)染色體上存在明顯的峰值,表型變異率分別為43.1%、28.65%、12.34%,其中qTCHRII是位于2號(hào)染色體2P5與2P6之間(205476~258897),qTCHRVII是位于7號(hào)染色體上7P17與7P14之間(1043692~156030),qTCHRXVI是位于16P16與16P17之間(591668~834952),2號(hào)、7號(hào)染色體表型變異率較高,該區(qū)間是影響糠醛耐受性的主效QTL。本研究建立密度合適的遺傳圖譜對(duì)釀酒酵母糠醛耐受性數(shù)量性狀初步定位,為進(jìn)一步精確定位以及選擇有利等位基因(分子標(biāo)記輔助育種MAS),提高育種的準(zhǔn)確性和預(yù)見(jiàn)性奠下基礎(chǔ)。
【圖文】：

第一章 緒論）、乙醛脫氫酶（ALD4P，ALD6P）、乙醛還原酶（ARI1P）、甲基乙二醛2P，GRE3P）[16-19]。Li 等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)新型編碼醛還原L131W，并利用 YEASTRACT 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其序列分析，Yap1p、Msn2/4p、PRpn4p 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子誘導(dǎo) YML131W 表達(dá)，其中 Yap1p、Msn2/4p、Pdr1脅迫應(yīng)激反應(yīng)[20, 21]。

因此在提高耐受性方面的研究逐漸引起關(guān)注，如圖1-2 所示，糠醛在低濃度下，釀酒酵母具有原位脫毒的作用，依賴于輔酶 NADH 醛還原酶降解糠醛并轉(zhuǎn)化為低毒性糠醇，減少了磷酸二羥丙酮的轉(zhuǎn)化從而減少了甘油的生成，使得碳的代謝流向乙醇的生成，得率提高[14]；但是高濃度的糠醛代謝使得 NADH 消耗過(guò)大，乙醇脫氫酶的活性被抑制，導(dǎo)致在酵母細(xì)胞內(nèi)的乙醛含量上升，菌體生長(zhǎng)受到抑制，乙醇產(chǎn)率下降，同時(shí)能誘導(dǎo)活性氧（ROS）的積累，引起線粒體、液泡膜、肌動(dòng)蛋白骨架和染色質(zhì)嚴(yán)重?fù)p害，各種代謝通路關(guān)鍵酶活性降低，從而抑制微生物的生長(zhǎng)[15]。根據(jù)以往對(duì)糠醛耐受性機(jī)制研究進(jìn)展來(lái)看，釀酒酵母將糠醛濃度降低同時(shí)轉(zhuǎn)化為較低毒性的糠醇過(guò)程需要多種相關(guān)脫氫酶和還原酶的參與，包括乙醇脫氫酶（ADH6P，ADH7P，，
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TQ223.122;TQ926

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