【摘要】：酵母中GPI型蛋白是細胞生存和維持正常細胞形態(tài)所必需的一類蛋白。本研究為了深入了解畢赤酵母GPI型蛋白,構建了畢赤酵母GPI型蛋白缺失菌株文庫并對其性能進行分析,通過表型篩選推測缺失蛋白可能的功能。對篩選到的一株甲醇耐受性缺失菌株,利用蛋白質組學和轉錄組學方法進行深入分析,了解菌株在甲醇脅迫條件下的響應特點及缺失蛋白的功能。同時利用固定化載體的疏水性顯著影響脂肪酶活力的原理,從缺失菌株庫中篩選表面疏水性顯著提高的菌株以及疏水蛋白修飾細胞表面兩種方法,有效改善脂肪酶的活力。具體研究內容及結果如下:(1)利用Cre/loxP重組酶系統,對畢赤酵母預測的50個潛在GPI型蛋白通過單基因敲除的方法,成功獲得45株,構成畢赤酵母GPI型蛋白缺失菌株文庫。對這些GPI蛋白缺失菌株進行性能分析,發(fā)現敲除的GPI型蛋白對細胞的生長都是非必需的。根據蛋白的缺失可能引起的細胞壁結構重構現象,從缺失菌株庫中篩選出5株甲醇耐受性顯著增加的菌株,4株細胞壁多糖含量顯著提高的菌株以及4株表面疏水性明顯提高的菌株,具有潛在的應用價值。(2)利用蛋白質組學分析方法對畢赤酵母的細胞壁蛋白進行深入分析,最終鑒定到畢赤酵母的164種細胞壁蛋白,并進行生物信息學分析,豐富了畢赤酵母細胞壁蛋白庫信息。對甲醇耐受菌株gcw19△在甲醇脅迫條件下的細胞壁蛋白響應特點進行研究,發(fā)現有大量未知功能的蛋白,細胞壁相關蛋白,壓力響應相關蛋白,蛋白合成及命運相關蛋白、代謝相關的蛋白以及和環(huán)境相互作用的蛋白都發(fā)生了顯著變化。這些蛋白的響應和變化最終形成了菌株gcw19△在甲醇脅迫條件下新的表面蛋白系統,使菌株能夠更好的適應環(huán)境。(3)利用轉錄組學分析方法全面了解甲醇耐受菌株gcw19△的基因表達情況。分析發(fā)現菌株gcw19△在甲醇脅迫條件下絕大部分預測到的GPI型蛋白,他們的基因轉錄水平都大幅度上調,引起了細胞表面蛋白的重構。此外菌株在氨基酸代謝途徑中也變化明顯,表現出有利于胞外氨基酸吸收進入胞內的特征,說明GCW19蛋白對氨基酸的吸收具有阻礙作用。通過實驗驗證也說明了菌株gcw19Δ對氨基酸的吸收利用強于對照菌株GS115。其他途徑如細胞壁合成途徑,細胞周期代謝途徑,甾醇合成途徑,蛋白質生物合成途徑、細胞應激途徑等也發(fā)現了差異變化基因,這些途徑的共同調控使菌株gcw19△能夠更好的適應甲醇脅迫的環(huán)境。(4)在GPI蛋白缺失菌株庫中篩選得到菌株gcw13Δ,gcw22Δ,ku70Δgcw30Δ和ku70Δgcw53Δ,他們的細胞表面都表現出明顯的強疏水特性。以這4株菌做為固定化載體,展示的脂肪酶CALB活力得到有效改善,其中菌株gcw22Δ/CALB-GCW61的酶活力在發(fā)酵120 h提高了69%。同時引入兩種來源不同的真菌疏水蛋白SC3和HFBI修飾細胞表面,發(fā)現同樣能提高細胞表面的疏水性特性,共展示脂肪酶時菌株GS115/HFBI-61/CALB-51表現出良好的表面疏水特性和脂肪酶活力,最終水解活力和合成活力分別提高了37%和109%。
【圖文】：

第一章 緒論第一章 緒 論細胞壁結構和組成概述細胞壁的結構胞是呈圓形或者卵圓形的單細胞真核生物，，直徑為 3-5μm。細胞層，能夠維持細胞的形態(tài)，在細胞與外界環(huán)境交流中發(fā)揮重要作母的細胞壁具有電子密度不同的兩層結構，厚度為 110-200nm。形狀類似  刷子‖，是酵母的甘露聚糖蛋白層，能夠通過蛋白水解密度較小，主要是一些微纖絲，能夠被 β-葡聚糖酶消化，說明該的，電鏡結果如圖 1-1 所示。

華南理工大學博士學位論文酵母細胞壁各組分之間也相互聯系，共同構成細胞壁的三維網狀結構。其中主要通過 O-糖苷鍵和 N-糖苷鍵和甘露糖結合，最終形成酵母的細胞壁甘露細胞壁的很多甘露糖蛋白可以先通過共價鍵和細胞壁的 β-1,6 葡聚糖連接，6 葡聚糖與 β-1,3 葡聚糖相連，或者直接和 β-1,3 葡聚糖連接。還有一部分甘過氫鍵等非共價鍵或者二硫鍵和 β-1,3-葡聚糖相互連接。幾丁質也可以通過的 β-1,4 糖苷鍵與 β-1,3 葡聚糖鏈的非還原末端連接，或者以 β-1,3-葡聚糖鏈連在 β-1,6 葡聚糖鏈上[7, 8]，細胞壁各組分的交聯方式如圖 1-2 所示。這些多相互交聯方式形成的網狀結構不僅為細胞壁提供了一定的機械強度，而且具性來應對外界環(huán)境的變化。例如正常滲透壓條件下細胞壁可大量的延伸，當滲透壓環(huán)境時，細胞壁結構可以在短時間內縮小至原來體積的 40%左右。當到正常的條件后，細胞壁結構又可恢復原狀且細胞能夠正常生活[9]。
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ926

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 朱泰承;李寅;;畢赤酵母表達系統發(fā)展概況及趨勢[J];生物工程學報;2015年06期

2 趙心清;張明明;徐桂紅;許建韌;白鳳武;;釀酒酵母乙酸耐性分子機制的功能基因組進展[J];生物工程學報;2014年03期

3 宋振玉;李楠;張姝;王雷;居勇;;低糖適應性耐凍酵母菌與普通酵母菌細胞構成成分的比較[J];中國釀造;2009年06期

4 孟云霞;何秀萍;劉楠;郭雪娜;張博潤;;甾醇C-24甲基轉移酶基因在釀酒酵母中的內源表達及工程菌麥角甾醇的合成[J];生物工程學報;2008年01期

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本文編號：2630170