【摘要】：酵母中GPI型蛋白是細(xì)胞生存和維持正常細(xì)胞形態(tài)所必需的一類蛋白。本研究為了深入了解畢赤酵母GPI型蛋白,構(gòu)建了畢赤酵母GPI型蛋白缺失菌株文庫(kù)并對(duì)其性能進(jìn)行分析,通過(guò)表型篩選推測(cè)缺失蛋白可能的功能。對(duì)篩選到的一株甲醇耐受性缺失菌株,利用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法進(jìn)行深入分析,了解菌株在甲醇脅迫條件下的響應(yīng)特點(diǎn)及缺失蛋白的功能。同時(shí)利用固定化載體的疏水性顯著影響脂肪酶活力的原理,從缺失菌株庫(kù)中篩選表面疏水性顯著提高的菌株以及疏水蛋白修飾細(xì)胞表面兩種方法,有效改善脂肪酶的活力。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng),對(duì)畢赤酵母預(yù)測(cè)的50個(gè)潛在GPI型蛋白通過(guò)單基因敲除的方法,成功獲得45株,構(gòu)成畢赤酵母GPI型蛋白缺失菌株文庫(kù)。對(duì)這些GPI蛋白缺失菌株進(jìn)行性能分析,發(fā)現(xiàn)敲除的GPI型蛋白對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)都是非必需的。根據(jù)蛋白的缺失可能引起的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)現(xiàn)象,從缺失菌株庫(kù)中篩選出5株甲醇耐受性顯著增加的菌株,4株細(xì)胞壁多糖含量顯著提高的菌株以及4株表面疏水性明顯提高的菌株,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。(2)利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法對(duì)畢赤酵母的細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行深入分析,最終鑒定到畢赤酵母的164種細(xì)胞壁蛋白,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,豐富了畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白庫(kù)信息。對(duì)甲醇耐受菌株gcw19△在甲醇脅迫條件下的細(xì)胞壁蛋白響應(yīng)特點(diǎn)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)有大量未知功能的蛋白,細(xì)胞壁相關(guān)蛋白,壓力響應(yīng)相關(guān)蛋白,蛋白合成及命運(yùn)相關(guān)蛋白、代謝相關(guān)的蛋白以及和環(huán)境相互作用的蛋白都發(fā)生了顯著變化。這些蛋白的響應(yīng)和變化最終形成了菌株gcw19△在甲醇脅迫條件下新的表面蛋白系統(tǒng),使菌株能夠更好的適應(yīng)環(huán)境。(3)利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法全面了解甲醇耐受菌株gcw19△的基因表達(dá)情況。分析發(fā)現(xiàn)菌株gcw19△在甲醇脅迫條件下絕大部分預(yù)測(cè)到的GPI型蛋白,他們的基因轉(zhuǎn)錄水平都大幅度上調(diào),引起了細(xì)胞表面蛋白的重構(gòu)。此外菌株在氨基酸代謝途徑中也變化明顯,表現(xiàn)出有利于胞外氨基酸吸收進(jìn)入胞內(nèi)的特征,說(shuō)明GCW19蛋白對(duì)氨基酸的吸收具有阻礙作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證也說(shuō)明了菌株gcw19Δ對(duì)氨基酸的吸收利用強(qiáng)于對(duì)照菌株GS115。其他途徑如細(xì)胞壁合成途徑,細(xì)胞周期代謝途徑,甾醇合成途徑,蛋白質(zhì)生物合成途徑、細(xì)胞應(yīng)激途徑等也發(fā)現(xiàn)了差異變化基因,這些途徑的共同調(diào)控使菌株gcw19△能夠更好的適應(yīng)甲醇脅迫的環(huán)境。(4)在GPI蛋白缺失菌株庫(kù)中篩選得到菌株gcw13Δ,gcw22Δ,ku70Δgcw30Δ和ku70Δgcw53Δ,他們的細(xì)胞表面都表現(xiàn)出明顯的強(qiáng)疏水特性。以這4株菌做為固定化載體,展示的脂肪酶CALB活力得到有效改善,其中菌株gcw22Δ/CALB-GCW61的酶活力在發(fā)酵120 h提高了69%。同時(shí)引入兩種來(lái)源不同的真菌疏水蛋白SC3和HFBI修飾細(xì)胞表面,發(fā)現(xiàn)同樣能提高細(xì)胞表面的疏水性特性,共展示脂肪酶時(shí)菌株GS115/HFBI-61/CALB-51表現(xiàn)出良好的表面疏水特性和脂肪酶活力,最終水解活力和合成活力分別提高了37%和109%。
【圖文】：

第一章 緒論第一章 緒 論細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成概述細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)胞是呈圓形或者卵圓形的單細(xì)胞真核生物，，直徑為 3-5μm。細(xì)胞層，能夠維持細(xì)胞的形態(tài)，在細(xì)胞與外界環(huán)境交流中發(fā)揮重要作母的細(xì)胞壁具有電子密度不同的兩層結(jié)構(gòu)，厚度為 110-200nm。形狀類似  刷子‖，是酵母的甘露聚糖蛋白層，能夠通過(guò)蛋白水解密度較小，主要是一些微纖絲，能夠被 β-葡聚糖酶消化，說(shuō)明該的，電鏡結(jié)果如圖 1-1 所示。

華南理工大學(xué)博士學(xué)位論文酵母細(xì)胞壁各組分之間也相互聯(lián)系，共同構(gòu)成細(xì)胞壁的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其中主要通過(guò) O-糖苷鍵和 N-糖苷鍵和甘露糖結(jié)合，最終形成酵母的細(xì)胞壁甘露細(xì)胞壁的很多甘露糖蛋白可以先通過(guò)共價(jià)鍵和細(xì)胞壁的 β-1,6 葡聚糖連接，6 葡聚糖與 β-1,3 葡聚糖相連，或者直接和 β-1,3 葡聚糖連接。還有一部分甘過(guò)氫鍵等非共價(jià)鍵或者二硫鍵和 β-1,3-葡聚糖相互連接。幾丁質(zhì)也可以通過(guò)的 β-1,4 糖苷鍵與 β-1,3 葡聚糖鏈的非還原末端連接，或者以 β-1,3-葡聚糖鏈連在 β-1,6 葡聚糖鏈上[7, 8]，細(xì)胞壁各組分的交聯(lián)方式如圖 1-2 所示。這些多相互交聯(lián)方式形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不僅為細(xì)胞壁提供了一定的機(jī)械強(qiáng)度，而且具性來(lái)應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化。例如正常滲透壓條件下細(xì)胞壁可大量的延伸，當(dāng)滲透壓環(huán)境時(shí)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)可以在短時(shí)間內(nèi)縮小至原來(lái)體積的 40%左右。當(dāng)?shù)秸５臈l件后，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)又可恢復(fù)原狀且細(xì)胞能夠正常生活[9]。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ926

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2630170