本文關(guān)鍵詞：Cas9介導(dǎo)的水牛奶相關(guān)基因的多位點(diǎn)基因打靶

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【摘要】：水牛奶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,富含鈣,能值高,奶品質(zhì)好。中國(guó)水牛的數(shù)量資源極其豐富,但水牛奶業(yè)的起步較晚,并且奶業(yè)的地域發(fā)展不平衡,因此,開(kāi)發(fā)水牛奶業(yè)具有重大意義。而牛乳中含量豐富的的αs1-酪蛋白在人乳中并不存在,同時(shí)也是人攝入牛奶時(shí)重要的過(guò)敏原。本研究選取與αs1-酪蛋白表達(dá)密切相關(guān)的CSN1S1基因和與產(chǎn)奶量密切相關(guān)的DGAT1基因,通過(guò)多位點(diǎn)基因打靶技術(shù)結(jié)合Cas9體外人工內(nèi)切酶對(duì)在水牛胎兒腎臟成纖維細(xì)胞對(duì)CSN1S1基因和DGAT1基因進(jìn)行靶向操作。首先,由公司針對(duì)CSN1S1基因的CDS序列設(shè)計(jì)三個(gè)RNAi靶位點(diǎn),分別構(gòu)建shRNA瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pGPU6-shRNA-NEO-1,pGPU6-shRNA-NEO-2,pGPU6-shRNA-NEO-3和陰性對(duì)照pGPU6-shRNA-NEO NC。然后通過(guò)EGFP真核表達(dá)載體pEGFP-N1和pEGFP-C2融合CSN1S1基因,構(gòu)建質(zhì)粒pEGFP-N1-CSN1S1和pEGFP-C2-CSN1S1。將shRNA瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒和綠色熒光融合表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,電子顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)情況。結(jié)果表明,三組shRNA瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒均可有效抑制綠色熒光的表達(dá),其中pGPU6-shRNA-NEO-2,pGPU6-shRNA-NEO-3的效果要稍好于pGPU6-shRNA-NEO-1。后提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA,經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄后用CSN1S1基因特異引物做半定量PCR,進(jìn)行灰度分析,結(jié)果也同時(shí)證明了三個(gè)靶點(diǎn)均有效,但三組shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)CSN1S1的干擾效果沒(méi)有顯著差異。然后,選擇shRNA瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pGPU6-shRNA-NEO-2,pGPU6-shRNA-NEO-3質(zhì)粒作為模板,設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增U6-shRNA-NEO片段,將其克隆到打靶載體骨架P UC19-HRDS1-HRDS2上面,進(jìn)而構(gòu)建針對(duì)CSN1S1基因的多位點(diǎn)打靶質(zhì)粒PUC19-H RDS1-U6-shRNA-NEO-HRDS2-1和PUC19-HRDS1-U6-shRNA-NEO-HRDS2-2。接著,由公司構(gòu)建DGAT1基因打靶質(zhì)粒PUC19-HRDS1-SV40-DGAT1-ZEO-pA-HRDS2。將打靶質(zhì)粒與Cas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染水牛胎兒牛腎成纖維細(xì)胞,設(shè)置三個(gè)對(duì)照組,分別是打靶質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染組,打靶質(zhì)粒和Cas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組,未經(jīng)轉(zhuǎn)染空細(xì)胞組,72h后分別提取每組細(xì)胞的基因組DNA,設(shè)計(jì)引物檢測(cè)基因的整合。結(jié)果表明,打靶質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染組,打靶質(zhì)粒和Cas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組均檢測(cè)到了基因的整合,空細(xì)胞組沒(méi)有基因的整合。之后設(shè)計(jì)定點(diǎn)整合引物,用提取的細(xì)胞基因組做模板,均未檢測(cè)到基因的定點(diǎn)整合。
【關(guān)鍵詞】：RNA干擾 多位點(diǎn)基因打靶 水牛 αs1-酪蛋白
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S823.83
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 常用縮略詞表6-9
• 1 前言9-14
• 2 材料與方法14-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、質(zhì)粒、菌種、基因14
• 2.1.2 主要試劑和耗材14-15
• 2.1.3 主要試劑配方15
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備15-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-34
• 2.2.1 RNAi瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建16
• 2.2.2 綠色熒光融合表達(dá)載體的構(gòu)建16-22
• 2.2.3 293T細(xì)胞的培養(yǎng)22-23
• 2.2.4 RNAi干擾效果的檢測(cè)23-28
• 2.2.5 CSN1S1打靶載體的構(gòu)建28-30
• 2.2.6 DGAT1打靶載體的構(gòu)建30
• 2.2.7 牛腎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)30-31
• 2.2.8 牛腎細(xì)胞的轉(zhuǎn)染以及外源基因的整合檢測(cè)31-34
• 3 結(jié)果與分析34-45
• 3.1 RNAi瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果34-35
• 3.2 融合熒光表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果35-37
• 3.3 干擾效果的驗(yàn)證結(jié)果37-41
• 3.3.1 熒光驗(yàn)證37-38
• 3.3.2 m RNA驗(yàn)證38-41
• 3.4 CSN1S1基因打靶載體的構(gòu)建結(jié)果41-42
• 3.5 DGAT1基因打靶載體的構(gòu)建結(jié)果42-43
• 3.6 牛腎胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染以及外源基因的整合檢測(cè)結(jié)果43-45
• 3.6.1 牛腎胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染43-44
• 3.6.2 外源基因的整合檢測(cè)結(jié)果44-45
• 4 討論45-48
• 4.1 RNAi序列的設(shè)計(jì)及篩選45-46
• 4.2 融合表達(dá)載體的構(gòu)建以及融合熒光的表達(dá)46
• 4.3 基因打靶載體的構(gòu)建46-47
• 4.4 基因整合結(jié)果的討論47-48
• 5 結(jié)論48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 附錄54-63

【參考文獻(xiàn)】

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