本文關鍵詞：青霉素菌渣堆肥工藝及青霉素抗性基因的分布影響研究

  更多相關文章： 青霉素菌渣 好氧堆肥 β-內(nèi)酰胺酶抗性基因 青霉素降解菌株

【摘要】：中國是抗生素的生產(chǎn)和使用大國,以青霉素為例,其生產(chǎn)和使用量在國內(nèi)始終居于首位。青霉素生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的菌渣,因其富含高蛋白,具有資源化回收或利用的可能,但菌渣中含有一定量的青霉素及其代謝產(chǎn)物,若處置不當,易引發(fā)抗生素抗性菌及抗性基因的誘導和富集,對環(huán)境和人類健康造成潛在威脅。本研究采用高溫好氧堆肥工藝,將青霉素菌渣與豬糞混合堆肥處理,以期消除菌渣中的青霉素殘留,實現(xiàn)菌渣的“變廢為寶”,同時探討青霉素菌渣堆肥過程中p-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的誘導富集效應,評價青霉素菌渣堆肥化處置的安全性。本研究以豬糞和青霉素菌渣為原料,以碎木屑為調(diào)節(jié)劑進行為期30d的高溫好氧堆肥,整個堆制過程在江蘇省南京市蔬菜科技園完成。堆肥過程中設置4個處理：處理1,豬糞：青霉素菌渣=1：1；處理2,豬糞：青霉素菌渣=2：1：處理3,豬糞：青霉素菌渣=4：1；對照組,純豬糞。通過檢測堆體的物理學、化學、生物學指標,對比分析不同青霉素菌渣添加比例對堆肥腐熟度的影響；基于實時熒光定量PCR (Real-time PCR)研究方法,對p-內(nèi)酰胺酶A (bla_(-TEM)、bla_(-CTX-M-1)、 bla_(-CTX-M-9))、B (bla_(-IMP-1)、bla_(-VIM-2)、bla_(-NDM-1))、C(bla_(-CMY))、D(bla_(-OXA-23))四類基因進行絕對定量,初步探討青霉素菌渣堆肥過程中β-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的演變過程；篩選青霉素降解菌,分析其降解特性,評價其成為青霉素菌渣堆肥菌劑的可行性。主要研究結論如下：經(jīng)過30d的堆制過程,4個處理組物理學、化學和生物學指標均顯示堆肥已腐熟,對比處理組和對照組堆肥理化參數(shù)發(fā)現(xiàn),添加青霉素菌渣有助于延長堆肥的高溫期。堆肥結束后,各處理的堆體溫度接近室溫,堆料顏色變?yōu)樯詈稚?堆體體積減小并變得松散,開始出現(xiàn)土腥味；pH值分別為7.3、7.4、7.3和7.9,EC值分別為6.3、5.5、5.3和4.3ms/cm;有機碳含量分別下降了14.1%、19.7%、17.7%和27.1%,總氮含量分別下降了27.4%、14.0%、4.4%和16.5%；發(fā)芽指數(shù)(GI)均超過80%,均達到了堆肥無植物毒性標準。高溫好氧堆肥方式可以有效降解青霉素菌渣中的青霉素殘留。運用超高效液相色譜(UPLC)法測定處理1、2、3的青霉素殘留濃度,分別由初始的(305.1±16.8) mg/kg、(208.6±4.2)mg/kg和(74.9±3.0)mg/kg降至濃度低于UPLC方法檢測限。各個處理的青霉素降解均符合一級反應動力學模型,處理1青霉素鈉的降解速率常數(shù)(κ)為0.3d~(-1),降解半衰期(tl/2)為1.9d；處理2青霉素鈉的k為0.2d-1,tl/2為2.4d；處理3青霉素鈉的κ為0.2dq,t1/2為2.3d,與常溫(25℃)下青霉素標準品的降解半衰期(39.4d)相比,堆肥化處理大大縮短了青霉素的降解時間。高溫好氧堆肥過程對不同處理組的p-內(nèi)酰胺酶不同基因型數(shù)量都有一定消減作用。堆肥結束(30d)后,4個處理中bla_(-TEM)基因數(shù)量與初始(0d)相比分別減少了69.4%、53.3%、67.9%和51.7%；bla_(-CTX-M-1)基因數(shù)量與初始相比分別減少了93.4%、98.8%、98.9%和84.6%；bla_(-CTX-M-9)基因數(shù)量與初始相比分別減少了99.0%、99.9%、99.9%和99.7%。bla_(-IMP-1)基因數(shù)量在處理1和處理2堆制結束分別增加至初始值的21.8和16.3倍,而處理3和對照組中bla_(-IMP-1基因數(shù)量與初始相比分別減少了99.8%和72.6%。處理1和處理3中bla_(-VIM-2)基因數(shù)量在堆肥結束后有所上升,分別增加為原來的0.7和4.0倍,處理2和對照組分別減少了99.8%和78.3%。bla_(-CMY)基因數(shù)量在處理1、2、3堆制過程中呈下降趨勢,至堆肥結束分別減少了80.5%、43.6%和88.3%。堆肥結束后,處理1和處理2中已檢測不到bla_(-OXA-23)基因,而處理3和對照組中該基因數(shù)量與初始相比分別減少了80.2%和74.3%。整個堆肥期間,各個處理樣品中均未檢測到bla_(-NDM-1)基因。通過平板劃線法從處理組篩選出—株青霉素高效降解新菌,命名PC-2~T ,已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC1.15283)。經(jīng)分子生物學鑒定,菌株PC-2~T 屬螯合球菌屬(Chelatococcus sp.)。經(jīng)形態(tài)學及革蘭氏染色觀察,菌株PC-2~T 是革蘭氏陰性菌,在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形,乳白色,表面光滑,中間有凸起,不透明,邊緣整齊,直徑約為1-2mm。在掃描電子顯微鏡下觀察為短桿狀,寬約為0.8～1.0μm,長約為1.8～2.81μm。主要脂肪酸為C18：1 w7c(50.7%)和C19:0 cyclo w8c(22.3%)。經(jīng)HPLC法測得的G+C mo1%含量為70.9mo1%。當葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、接種量為14%、pH為6-8時,菌株PC-2~T 在37℃下振蕩培養(yǎng)6 h,對底物濃度為400 mg/L的青霉素鈉的降解率達98%以上。青霉素菌渣堆肥產(chǎn)品各理化指標及生物學指標已達腐熟標準,能夠用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。高溫好氧堆肥過程對典型的幾類p-內(nèi)酰胺酶基因數(shù)量有一定的消減作用,但青霉素菌渣是否會誘導不同種類的抗生素抗性菌群,以及在病原微生物中的基因水平轉移等科學問題還需進一步開展研究。
【關鍵詞】：青霉素菌渣 好氧堆肥 β-內(nèi)酰胺酶抗性基因 青霉素降解菌株
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X787;S141.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 緒論12-22
• 1.1 課題背景12-13
• 1.1.1 課題來源12
• 1.1.2 課題研究目的和意義12-13
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀13-20
• 1.2.1 青霉素菌渣處理處置現(xiàn)狀13-14
• 1.2.2 青霉素菌渣堆肥化處理處置現(xiàn)狀14-17
• 1.2.3 抗生素抗性基因在堆肥過程中的富集、誘導研究進展17-20
• 1.2.4 微生物菌劑在堆肥中的應用20
• 1.3 主要研究內(nèi)容20-21
• 1.4 研究技術路線21-22
• 第二章 青霉素菌渣與豬糞混合堆肥工藝研究22-32
• 2.1 實驗材料、試劑和方法22-25
• 2.1.1 堆肥原料及理化性質(zhì)22
• 2.1.2 主要實驗試劑及儀器22-23
• 2.1.3 堆肥過程與樣品采集23
• 2.1.4 主要理化指標及測定方法23-25
• 2.2 結果討論25-30
• 2.2.1 堆體表觀特征的變化25
• 2.2.2 堆肥過程中溫度的變化25-26
• 2.2.3 堆肥過程中含水率的變化26
• 2.2.4 堆肥過程中pH的變化26-27
• 2.2.5 堆肥過程中電導率(EC)的變化27-28
• 2.2.6 堆肥過程中總有機碳的變化28
• 2.2.7 堆肥過程中總氮的變化28-29
• 2.2.8 發(fā)芽指數(shù)(GI)的變化29-30
• 2.3 小結30-32
• 第三章 堆肥過程中青霉素殘留對B-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的誘導富集效應32-52
• 3.1 主要實驗試劑及儀器32-33
• 3.2 青霉素殘留降解的動態(tài)變化33-34
• 3.2.1 超高效液相色譜(UPLC)檢測條件33
• 3.2.2 加速溶劑萃取(ASE)與SPE凈化33-34
• 3.2.3 超高效液相色譜檢測(UPLC)34
• 3.3 堆肥過程中B-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的數(shù)量變化34-37
• 3.3.1 目的基因引物、探針序列34-35
• 3.3.2 qPCR標準曲線的繪制35
• 3.3.3 標準品的制作35-37
• 3.3.4 標準曲線的繪制37
• 3.3.5 堆肥樣品分析37
• 3.4 結果討論37-50
• 3.4.1 青霉素鈉標準曲線的繪制37
• 3.4.2 青霉素殘留降解曲線及其降解動力學曲線37-38
• 3.4.3 青霉素降解動力學38-39
• 3.4.4 青霉素菌渣堆肥過程中細菌、放線菌數(shù)量變化39-40
• 3.4.5 β-內(nèi)酰胺酶基因型菌群在堆肥過程中的數(shù)量變化40-50
• 3.5 小結50-52
• 第四章 一株青霉素降解新菌的分類鑒定及降解特性分析52-64
• 4.1 主要實驗材料和儀器52-53
• 4.1.1 實驗藥品、試劑及儀器52
• 4.1.2 培養(yǎng)基52-53
• 4.1.3 模式菌株53
• 4.2 實驗方法53-56
• 4.2.1 青霉素降解菌株的分離、篩選53
• 4.2.2 基因組DNA提取、PCR擴增及序列分析53-54
• 4.2.3 菌株PC-2~T表型特征分析54-55
• 4.2.4 菌株PC-2~T細胞脂肪酸測定55
• 4.2.5 菌株PC-2~T遺傳特征分析55
• 4.2.6 菌株PC-2~T降解特性分析55-56
• 4.3 實驗結果56-63
• 4.3.1 青霉素降解菌株的分離與保藏56
• 4.3.2 菌株PC-2~T的形態(tài)特征56-57
• 4.3.3 細菌生長特征57
• 4.3.4 抗生素敏感性實驗57-58
• 4.3.5 生理生化特征58-59
• 4.3.6 細胞脂肪酸組分59
• 4.3.7 菌株PC-2~T遺傳特征59-61
• 4.3.8 菌株PC-2~T降解特性分析61-63
• 4.4 討論63
• 4.5 小結63-64
• 第五章 結論與展望64-66
• 5.1 結論64-65
• 5.2 展望65-66
• 參考文獻66-73
• 致謝73-74
• 在校期間發(fā)表論文情況74

【參考文獻】

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本文編號：975984