本文關(guān)鍵詞：青霉素菌渣堆肥工藝及青霉素抗性基因的分布影響研究

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【摘要】：中國是抗生素的生產(chǎn)和使用大國,以青霉素為例,其生產(chǎn)和使用量在國內(nèi)始終居于首位。青霉素生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的菌渣,因其富含高蛋白,具有資源化回收或利用的可能,但菌渣中含有一定量的青霉素及其代謝產(chǎn)物,若處置不當(dāng),易引發(fā)抗生素抗性菌及抗性基因的誘導(dǎo)和富集,對環(huán)境和人類健康造成潛在威脅。本研究采用高溫好氧堆肥工藝,將青霉素菌渣與豬糞混合堆肥處理,以期消除菌渣中的青霉素殘留,實現(xiàn)菌渣的“變廢為寶”,同時探討青霉素菌渣堆肥過程中p-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的誘導(dǎo)富集效應(yīng),評價青霉素菌渣堆肥化處置的安全性。本研究以豬糞和青霉素菌渣為原料,以碎木屑為調(diào)節(jié)劑進(jìn)行為期30d的高溫好氧堆肥,整個堆制過程在江蘇省南京市蔬菜科技園完成。堆肥過程中設(shè)置4個處理：處理1,豬糞：青霉素菌渣=1：1；處理2,豬糞：青霉素菌渣=2：1：處理3,豬糞：青霉素菌渣=4：1；對照組,純豬糞。通過檢測堆體的物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)指標(biāo),對比分析不同青霉素菌渣添加比例對堆肥腐熟度的影響；基于實時熒光定量PCR (Real-time PCR)研究方法,對p-內(nèi)酰胺酶A (bla_(-TEM)、bla_(-CTX-M-1)、 bla_(-CTX-M-9))、B (bla_(-IMP-1)、bla_(-VIM-2)、bla_(-NDM-1))、C(bla_(-CMY))、D(bla_(-OXA-23))四類基因進(jìn)行絕對定量,初步探討青霉素菌渣堆肥過程中β-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的演變過程；篩選青霉素降解菌,分析其降解特性,評價其成為青霉素菌渣堆肥菌劑的可行性。主要研究結(jié)論如下：經(jīng)過30d的堆制過程,4個處理組物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)指標(biāo)均顯示堆肥已腐熟,對比處理組和對照組堆肥理化參數(shù)發(fā)現(xiàn),添加青霉素菌渣有助于延長堆肥的高溫期。堆肥結(jié)束后,各處理的堆體溫度接近室溫,堆料顏色變?yōu)樯詈稚?堆體體積減小并變得松散,開始出現(xiàn)土腥味；pH值分別為7.3、7.4、7.3和7.9,EC值分別為6.3、5.5、5.3和4.3ms/cm;有機(jī)碳含量分別下降了14.1%、19.7%、17.7%和27.1%,總氮含量分別下降了27.4%、14.0%、4.4%和16.5%；發(fā)芽指數(shù)(GI)均超過80%,均達(dá)到了堆肥無植物毒性標(biāo)準(zhǔn)。高溫好氧堆肥方式可以有效降解青霉素菌渣中的青霉素殘留。運用超高效液相色譜(UPLC)法測定處理1、2、3的青霉素殘留濃度,分別由初始的(305.1±16.8) mg/kg、(208.6±4.2)mg/kg和(74.9±3.0)mg/kg降至濃度低于UPLC方法檢測限。各個處理的青霉素降解均符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型,處理1青霉素鈉的降解速率常數(shù)(κ)為0.3d~(-1),降解半衰期(tl/2)為1.9d；處理2青霉素鈉的k為0.2d-1,tl/2為2.4d；處理3青霉素鈉的κ為0.2dq,t1/2為2.3d,與常溫(25℃)下青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的降解半衰期(39.4d)相比,堆肥化處理大大縮短了青霉素的降解時間。高溫好氧堆肥過程對不同處理組的p-內(nèi)酰胺酶不同基因型數(shù)量都有一定消減作用。堆肥結(jié)束(30d)后,4個處理中bla_(-TEM)基因數(shù)量與初始(0d)相比分別減少了69.4%、53.3%、67.9%和51.7%；bla_(-CTX-M-1)基因數(shù)量與初始相比分別減少了93.4%、98.8%、98.9%和84.6%；bla_(-CTX-M-9)基因數(shù)量與初始相比分別減少了99.0%、99.9%、99.9%和99.7%。bla_(-IMP-1)基因數(shù)量在處理1和處理2堆制結(jié)束分別增加至初始值的21.8和16.3倍,而處理3和對照組中bla_(-IMP-1基因數(shù)量與初始相比分別減少了99.8%和72.6%。處理1和處理3中bla_(-VIM-2)基因數(shù)量在堆肥結(jié)束后有所上升,分別增加為原來的0.7和4.0倍,處理2和對照組分別減少了99.8%和78.3%。bla_(-CMY)基因數(shù)量在處理1、2、3堆制過程中呈下降趨勢,至堆肥結(jié)束分別減少了80.5%、43.6%和88.3%。堆肥結(jié)束后,處理1和處理2中已檢測不到bla_(-OXA-23)基因,而處理3和對照組中該基因數(shù)量與初始相比分別減少了80.2%和74.3%。整個堆肥期間,各個處理樣品中均未檢測到bla_(-NDM-1)基因。通過平板劃線法從處理組篩選出—株青霉素高效降解新菌,命名PC-2~T ,已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC1.15283)。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定,菌株P(guān)C-2~T 屬螯合球菌屬(Chelatococcus sp.)。經(jīng)形態(tài)學(xué)及革蘭氏染色觀察,菌株P(guān)C-2~T 是革蘭氏陰性菌,在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形,乳白色,表面光滑,中間有凸起,不透明,邊緣整齊,直徑約為1-2mm。在掃描電子顯微鏡下觀察為短桿狀,寬約為0.8～1.0μm,長約為1.8～2.81μm。主要脂肪酸為C18：1 w7c(50.7%)和C19:0 cyclo w8c(22.3%)。經(jīng)HPLC法測得的G+C mo1%含量為70.9mo1%。當(dāng)葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、接種量為14%、pH為6-8時,菌株P(guān)C-2~T 在37℃下振蕩培養(yǎng)6 h,對底物濃度為400 mg/L的青霉素鈉的降解率達(dá)98%以上。青霉素菌渣堆肥產(chǎn)品各理化指標(biāo)及生物學(xué)指標(biāo)已達(dá)腐熟標(biāo)準(zhǔn),能夠用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。高溫好氧堆肥過程對典型的幾類p-內(nèi)酰胺酶基因數(shù)量有一定的消減作用,但青霉素菌渣是否會誘導(dǎo)不同種類的抗生素抗性菌群,以及在病原微生物中的基因水平轉(zhuǎn)移等科學(xué)問題還需進(jìn)一步開展研究。
【關(guān)鍵詞】：青霉素菌渣 好氧堆肥 β-內(nèi)酰胺酶抗性基因 青霉素降解菌株
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X787;S141.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 緒論12-22
• 1.1 課題背景12-13
• 1.1.1 課題來源12
• 1.1.2 課題研究目的和意義12-13
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀13-20
• 1.2.1 青霉素菌渣處理處置現(xiàn)狀13-14
• 1.2.2 青霉素菌渣堆肥化處理處置現(xiàn)狀14-17
• 1.2.3 抗生素抗性基因在堆肥過程中的富集、誘導(dǎo)研究進(jìn)展17-20
• 1.2.4 微生物菌劑在堆肥中的應(yīng)用20
• 1.3 主要研究內(nèi)容20-21
• 1.4 研究技術(shù)路線21-22
• 第二章 青霉素菌渣與豬糞混合堆肥工藝研究22-32
• 2.1 實驗材料、試劑和方法22-25
• 2.1.1 堆肥原料及理化性質(zhì)22
• 2.1.2 主要實驗試劑及儀器22-23
• 2.1.3 堆肥過程與樣品采集23
• 2.1.4 主要理化指標(biāo)及測定方法23-25
• 2.2 結(jié)果討論25-30
• 2.2.1 堆體表觀特征的變化25
• 2.2.2 堆肥過程中溫度的變化25-26
• 2.2.3 堆肥過程中含水率的變化26
• 2.2.4 堆肥過程中pH的變化26-27
• 2.2.5 堆肥過程中電導(dǎo)率(EC)的變化27-28
• 2.2.6 堆肥過程中總有機(jī)碳的變化28
• 2.2.7 堆肥過程中總氮的變化28-29
• 2.2.8 發(fā)芽指數(shù)(GI)的變化29-30
• 2.3 小結(jié)30-32
• 第三章 堆肥過程中青霉素殘留對B-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的誘導(dǎo)富集效應(yīng)32-52
• 3.1 主要實驗試劑及儀器32-33
• 3.2 青霉素殘留降解的動態(tài)變化33-34
• 3.2.1 超高效液相色譜(UPLC)檢測條件33
• 3.2.2 加速溶劑萃取(ASE)與SPE凈化33-34
• 3.2.3 超高效液相色譜檢測(UPLC)34
• 3.3 堆肥過程中B-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的數(shù)量變化34-37
• 3.3.1 目的基因引物、探針序列34-35
• 3.3.2 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制35
• 3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制作35-37
• 3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制37
• 3.3.5 堆肥樣品分析37
• 3.4 結(jié)果討論37-50
• 3.4.1 青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制37
• 3.4.2 青霉素殘留降解曲線及其降解動力學(xué)曲線37-38
• 3.4.3 青霉素降解動力學(xué)38-39
• 3.4.4 青霉素菌渣堆肥過程中細(xì)菌、放線菌數(shù)量變化39-40
• 3.4.5 β-內(nèi)酰胺酶基因型菌群在堆肥過程中的數(shù)量變化40-50
• 3.5 小結(jié)50-52
• 第四章 一株青霉素降解新菌的分類鑒定及降解特性分析52-64
• 4.1 主要實驗材料和儀器52-53
• 4.1.1 實驗藥品、試劑及儀器52
• 4.1.2 培養(yǎng)基52-53
• 4.1.3 模式菌株53
• 4.2 實驗方法53-56
• 4.2.1 青霉素降解菌株的分離、篩選53
• 4.2.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列分析53-54
• 4.2.3 菌株P(guān)C-2~T表型特征分析54-55
• 4.2.4 菌株P(guān)C-2~T細(xì)胞脂肪酸測定55
• 4.2.5 菌株P(guān)C-2~T遺傳特征分析55
• 4.2.6 菌株P(guān)C-2~T降解特性分析55-56
• 4.3 實驗結(jié)果56-63
• 4.3.1 青霉素降解菌株的分離與保藏56
• 4.3.2 菌株P(guān)C-2~T的形態(tài)特征56-57
• 4.3.3 細(xì)菌生長特征57
• 4.3.4 抗生素敏感性實驗57-58
• 4.3.5 生理生化特征58-59
• 4.3.6 細(xì)胞脂肪酸組分59
• 4.3.7 菌株P(guān)C-2~T遺傳特征59-61
• 4.3.8 菌株P(guān)C-2~T降解特性分析61-63
• 4.4 討論63
• 4.5 小結(jié)63-64
• 第五章 結(jié)論與展望64-66
• 5.1 結(jié)論64-65
• 5.2 展望65-66
• 參考文獻(xiàn)66-73
• 致謝73-74
• 在校期間發(fā)表論文情況74

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：975984