本文關(guān)鍵詞：番茄根結(jié)巨型細(xì)胞凋亡相關(guān)基因MiPDCD6和LeMYB330的沉默效應(yīng)研究

  更多相關(guān)文章： 南方根結(jié)線蟲 MiPDCD6基因 LeMYB330基因 RNAi VIGS(病毒介導(dǎo)的基因沉默)

【摘要】：根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)是一類重要的植物病原線蟲,可以侵染3000多種植物,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失,據(jù)估計,全球每年因根結(jié)線蟲所造成的損失超過1000億美元。其2齡幼蟲侵人寄主根系,食道腺分泌物經(jīng)口針注入植物細(xì)胞,從而刺激寄主植物根部形成巨型細(xì)胞并產(chǎn)生根結(jié)。根結(jié)線蟲食道腺蛋白在線蟲與寄主植物互作過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在根結(jié)線蟲侵染番茄近一個月后,巨型細(xì)胞逐漸出現(xiàn)空泡化,內(nèi)含物大幅度減少,由此推測根結(jié)線蟲食道腺分泌蛋白是否啟動了寄主植物的自主凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究以南方根結(jié)線蟲中編碼程序性死亡蛋白6(Programmed cell death protein 6,PDCD6)基因和與之互作的番茄根組織MYB相關(guān)蛋白330(Myb-related protein 330-like)基因為研究對象,用RNAi和VIGS技術(shù)研究了MiPDCD6基因和LeMYB330基因的功能,為揭示南方根結(jié)線蟲調(diào)控其寄主巨型細(xì)胞空泡化的分子機理和抗根結(jié)線蟲育種奠定了良好的基礎(chǔ)。本研究主要取得如下創(chuàng)新性結(jié)果:1、揭示了南方根結(jié)線蟲Mi PDCD6基因的體外沉默效應(yīng),利用RNAi技術(shù),將南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲浸泡在含有1%間苯二酚,2 mg/mL Mi PDCD6 dsRNA溶液中4h,分別以GFP dsRNA溶液和M9 buffer做為對照。發(fā)現(xiàn)用合成的MiPDCD6和GFP的dsRNA對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲進行浸泡處理,在25℃條件下浸泡4h,處理組和對照組的線蟲都處于僵直狀態(tài),用清水使線蟲復(fù)蘇4h后,對照組線蟲恢復(fù)正�；顒�,而處理組線蟲出現(xiàn)不規(guī)則扭曲運動和抽搐現(xiàn)象。隨機統(tǒng)計100條發(fā)現(xiàn),處理組與對照組線蟲死亡僵直百分?jǐn)?shù)存在顯著性差異。半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明:被dsRNA侵泡后的南方根結(jié)線蟲MiPDCD6基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低。將處理過的2齡幼蟲接種到空心菜根部28d后,寄主空心菜的根結(jié)數(shù)顯著降低46.3%。上述研究結(jié)果表明MiPDCD6基因在南方根結(jié)線蟲寄生過程中具有重要的調(diào)控作用。2、揭示了南方根結(jié)線蟲MiPDCD6基因的體內(nèi)沉默效應(yīng),利用VIGS技術(shù),構(gòu)建pTRV-Mi PDCD6病毒載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法,沉默了南方根結(jié)線蟲MiPDCD6基因,并分析了其對番茄根結(jié)數(shù)量的影響。接種35d后,pTRV-Mi PDCD6處理的番茄植株中線蟲MiPDCD6表達(dá)量顯著下調(diào),沉默處理的番茄植株根結(jié)數(shù)比清水處理組減少62.8%,卵囊數(shù)減少60%。結(jié)果表明,MiPDCD6基因沉默對根結(jié)線蟲病害具有很好的防控效果,也說明MiPDCD6基因可能參與線蟲的寄生過程,并在其中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。3、揭示了番茄LeMYB330基因的沉默效應(yīng),利用VIGS技術(shù),構(gòu)建pTRV-LeMYB330病毒載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法,沉默了番茄LeMYB330基因,并分析了其對番茄根結(jié)數(shù)量的影響。接種35d后,pTRV-LeMYB330處理的番茄植株中LeMYB330基因表達(dá)量顯著下調(diào),沉默處理的番茄植株根結(jié)數(shù)比清水處理組增多6.9%,卵囊數(shù)增多15.3%,但未達(dá)到顯著水平。結(jié)果表明,LeMYB330基因沉默可能降低了番茄對根結(jié)線蟲的抗性,更加有利于根結(jié)線蟲的侵染。
【關(guān)鍵詞】：南方根結(jié)線蟲 MiPDCD6基因 LeMYB330基因 RNAi VIGS(病毒介導(dǎo)的基因沉默)
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.412
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮寫詞及英漢對照7-12
• 1 前言12-23
• 1.1 根結(jié)線蟲病的發(fā)生與防治概況12-14
• 1.2 RNAi及其在基因功能研究中的應(yīng)用14-16
• 1.2.1 RNAi的機制15
• 1.2.2 RNAi技術(shù)在防治植物寄生線蟲上的應(yīng)用15-16
• 1.3 VIGS技術(shù)及其在基因功能研究中的應(yīng)用16-18
• 1.3.1 VIGS的定義及原理16-17
• 1.3.2 VIGS技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用17-18
• 1.4 PDCD6基因功能研究進展18-19
• 1.5 MYB基因功能研究進展19-21
• 1.6 研究目的和意義21-23
• 2 材料與方法23-44
• 2.1 材料23-26
• 2.1.1 實驗材料23
• 2.1.2 供試植物23
• 2.1.3 菌株及質(zhì)粒載體23
• 2.1.4 供試試劑及配制23-24
• 2.1.5 培養(yǎng)基24-25
• 2.1.6 電泳25
• 2.1.7 提取RNA的實驗用品及試劑25
• 2.1.8 常用儀器設(shè)備25-26
• 2.2 方法26-44
• 2.2.1 植物材料培養(yǎng)26
• 2.2.2 線蟲接種26
• 2.2.3 侵染前二齡幼蟲的收集26
• 2.2.4 MiPDCD6基因的體外RNAi26-31
• 2.2.5 半定量RT-PCR檢測干涉效果31-34
• 2.2.6 南方根結(jié)線蟲MiPDCD6基因和番茄LeMYB330基因的VIGS效應(yīng)34-44
• 3 結(jié)果與分析44-58
• 3.1 MiPDCD6基因的體外RNAi效應(yīng)44-49
• 3.1.1 MiPDCD6基因和外源基因GFP體外轉(zhuǎn)錄模板的制備44
• 3.1.2 MiPDCD6基因和外源基因GFP的dsRNA合成44-45
• 3.1.3 MiPDCD6和GFP體外RNAi對線蟲活力的影響45-46
• 3.1.4 MiPDCD6和GFP體外RNAi對南方根結(jié)線蟲侵染力的影響46-47
• 3.1.5 半定量RT-RCR檢測dsRNA浸泡對MiPDCD6表達(dá)量的影響47-49
• 3.2 南方根結(jié)線蟲MiPDCD6基因和番茄LeMYB330基因的VIGS效應(yīng)49-58
• 3.2.1 目的基因片段的克隆與鑒定49-52
• 3.2.2 VIGS載體的構(gòu)建與鑒定52-54
• 3.2.3 VIGS結(jié)果與檢測54-58
• 4 結(jié)論與討論58-64
• 4.1 結(jié)論58
• 4.2 討論58-64
• 4.2.1 南方根結(jié)線蟲MiPDCD6基因體外RNAi58-60
• 4.2.2 南方根結(jié)線蟲MiPDCD6基因VIGS效應(yīng)分析60
• 4.2.3 番茄LeMYB330基因的VIGS效應(yīng)分析60-61
• 4.2.4 影響VIGS的因素61-64
• 致謝64-65
• 參考文獻(xiàn)65-71
• 附錄71-72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 黃賽花;鄭桂杰;楊永慶;智海劍;;利用VIGS技術(shù)對抗SMV候選基因GmZ15的功能分析[J];大豆科學(xué);2015年04期

2 徐海燕;泮曉丹;應(yīng)莉莎;吳軍舟;張平;蘇丹;;程序性細(xì)胞死亡6對促進卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移作用的效應(yīng)分子研究[J];腫瘤學(xué)雜志;2015年02期

3 喬丹娜;李華義;韓興;張艷杰;沈鳳英;劉大群;李亞寧;;玫瑰黃鏈霉菌片劑對根結(jié)線蟲病的防治作用及對土壤微生物區(qū)系的影響[J];農(nóng)藥學(xué)學(xué)報;2015年02期

4 齊江衛(wèi);龔亮;王會冬;桑松;胡美英;翁群芳;;RNAi及其在害蟲防治中的應(yīng)用[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年07期

5 梅眉;黃永紅;茆振川;劉志敏;謝丙炎;;南方根結(jié)線蟲乳酸脫氫酶基因克隆及其沉默效應(yīng)分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年16期

6 顧建鋒;王江嶺;王金成;;根結(jié)線蟲非中國種問題初探[J];植物檢疫;2012年03期

7 劉守梅;孫玉強;王慧中;;植物MYB轉(zhuǎn)錄因子研究[J];杭州師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年02期

8 李亞軍;田振東;柳俊;謝從華;;利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)快速鑒定兩個馬鈴薯晚疫病抗性相關(guān)EST片段EL732276和EL732318的功能[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2012年01期

9 Masatoshi MAKI;Hironori SUZUKI;Hideki SHIBATA;;Structure and function of ALG-2,a penta-EF-hand calcium-dependent adaptor protein[J];Science China(Life Sciences);2011年08期

10 許小艷;劉峰;康厚祥;張竹青;鄒學(xué)校;謝丙炎;;辣椒抗根結(jié)線蟲基因Me3的精細(xì)定位[J];園藝學(xué)報;2011年02期

，

本文編號：898889