本文關(guān)鍵詞：microRNAs對黃牛和水牛朊病毒基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究

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【摘要】：朊病毒疾病(Prion diseases)是一類由朊病毒(Prion protein,PrP)引起的致死性神經(jīng)退行性疾病,又稱為傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathies,TSE)。如牛的瘋牛病、羊的瘙癢癥,以及人的變異型克雅氏癥等。目前普遍認(rèn)可的致病原因是由于細(xì)胞表達(dá)的正常型朊蛋白(PrPC),在外界誘因作用下構(gòu)象發(fā)生改變,形成異常的致病型朊病毒(PrPsc)。其中致病型朊病毒會(huì)不斷誘導(dǎo)正常型朊病毒轉(zhuǎn)變成致病型病毒,進(jìn)而使致病型病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中迅速積累,最終使疾病爆發(fā)。目前,全球已有近20萬頭的黃牛被報(bào)道感染瘋牛病,但是至今沒有水牛感染瘋牛病的報(bào)道。我們以往的研究結(jié)果顯示,遺傳因素在水牛和黃牛對疾病的易感性上有著不可忽視的作用。我們分析了于疾病傳染性相關(guān)的幾個(gè)重要組織中朊病毒基因(PRNP)和朊病毒蛋白(PrP)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示：在幾類組織中,黃牛的PrP表達(dá)顯著高于水牛。但有趣的是,PRNP mRNA轉(zhuǎn)錄和PrP翻譯不是同步的,提示在黃牛和水牛中PRNP基因可能受到了復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。因此,深入研究PRNP基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)朊病毒疾病的致病機(jī)理。microRNA(miRNA)是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)的重要方式。miRNA在細(xì)胞中參與了許多重要生物過程,如發(fā)育、增殖、分化、凋亡等,與生物體的發(fā)育和疾病密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)與朊病毒疾病的易感性、發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究中,我們從miRNA對靶基因的調(diào)控入手,解析了miRNA調(diào)控黃牛和水牛PRNP基因轉(zhuǎn)錄后差異表達(dá)的分子機(jī)制。首先,通過3'RACE和測序技術(shù),我們注釋了水牛PRNP基因的3'UTR；然后,分析了黃牛和水牛PRNP基因3'UTR的種間固定差異,通過對12頭黃牛和14頭水牛的PRNP基因3'UTR進(jìn)行全長測序,共檢測到144個(gè)種間固定差異位點(diǎn),包括水牛中UTR-1區(qū)(包含g.67352-67379del→28-bp插入和g.67387-g.67388TG→CC)和UTR-2區(qū)(含有一個(gè)AG插入位點(diǎn),即g.67468de1→A,g.67469del→G)多態(tài)；接下來,擴(kuò)大樣本量重測序了這兩個(gè)區(qū)域,其中UTR-1區(qū)用了162個(gè)水牛樣品,194個(gè)黃牛樣品重測序,而UTR-2區(qū)用了174個(gè)水牛樣品,192個(gè)黃牛樣品重測序；結(jié)果發(fā)現(xiàn)水牛中UTR-1區(qū)中28-bp插入及兩個(gè)堿基替換頻率為80.2%,而UTR-2區(qū)中AG插入頻率為96.0%,但是黃牛均無以上現(xiàn)象；我們用軟件預(yù)測到有17個(gè)miRNAs可能作用于這兩個(gè)區(qū)域。進(jìn)一步的熒光雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中有5個(gè)miRNAs具有調(diào)控作用,它們是作用于UTR-1的miR-145-5P、miR-328-3P、miR-338-3P和作用于UTR-2的是miR-125b-5P和miR-331-3P:最后,我們采用qPCR的方法檢測了這5個(gè)miRNAs在黃牛和水牛腦閂中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)這5個(gè)miRNAs在黃牛和水牛腦閂中均有表達(dá)；與其它miRNA相比,miR-125b-5p的表達(dá)量在黃牛和水牛中都是最高的；有意思的是,miR-331-3P在水牛腦閂中的含量要顯著高于黃牛。我們推測miR-331-3P調(diào)控水牛PRNP基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá),可能是導(dǎo)致水牛的朊病毒蛋白表達(dá)低于黃牛的原因,揭示了黃牛和水牛PNRP基因不同的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。本研究從新的視角探討水牛和黃牛朊病毒疾病易感性差異的原因。研究結(jié)果將為解析懸而未決的朊病毒疾病致病機(jī)理的提供有意義的線索,為朊病毒疾病的治療提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：朊病毒疾病 miRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 PRNP 3'UTR
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一部分 背景9-20
• 一、朊病毒疾病的種類9-11
• 1 瘋牛病9-10
• 2 羊瘙癢病10
• 3 貓科動(dòng)物海綿狀腦病10-11
• 4 變異型克雅氏病11
• 二、朊蛋白基因的研究進(jìn)展11-15
• 1 PRNP基因的功能及其與朊病毒疾病的關(guān)系11-14
• 2 黃牛和水牛PRNP基因轉(zhuǎn)錄前后表達(dá)差異的研究14-15
• 三、MicroRNA與朊病毒疾病15-19
• 1 MicroRNA的產(chǎn)生15-17
• 2 miRNA的特點(diǎn)17
• 3 miRNA與朊病毒疾病的關(guān)系17-19
• 四、本研究目的19-20
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)材料和方法20-43
• 1 實(shí)驗(yàn)材料20-23
• 1.1 實(shí)驗(yàn)樣品20-21
• 1.2 主要儀器21-22
• 1.3 主要試劑22-23
• 1.4 主要試劑盒23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-43
• 2.1 用于3'RACE的cDNA的制備23-25
• 2.2 用于miRNA表達(dá)量分析的cDNA的制備25-26
• 2.3 3'RACE技術(shù)確認(rèn)水牛PRNP基因3'UTR26-27
• 2.4 產(chǎn)物的回收27-28
• 2.5 測序28-30
• 2.6 DNA提取30-31
• 2.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增黃牛和水牛PRNP基因3'UTR31-33
• 2.8 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增PRNP3'UTR區(qū)固定差異位點(diǎn)33-35
• 2.8.1 PCR擴(kuò)增和測序黃牛和水牛UTR-1區(qū)33-34
• 2.8.2 PCR擴(kuò)增和測序黃牛和水牛UTR-2區(qū)34-35
• 2.9 克隆35-36
• 2.10 質(zhì)粒提取36
• 2.11 miRNA的識(shí)別預(yù)測36
• 2.12 熒光雙報(bào)告載體構(gòu)建36-40
• 2.13 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光雙報(bào)告檢測40
• 2.14 熒光定量PCR擴(kuò)增40-42
• 2.15 miRNA相對表達(dá)量的計(jì)算42-43
• 第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-54
• 1 水牛PRNP基因3'UTR的注釋43-45
• 2 黃牛和水牛PRNP基因3'UTR的擴(kuò)增和測序結(jié)果45-49
• 2.1 PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果45-48
• 2.2 檢測UTR-1區(qū)在黃牛和水牛群體中的分布情況48-49
• 2.3 PCR擴(kuò)增和測序黃牛和水牛UTR-2區(qū)的統(tǒng)計(jì)49
• 3 miRNA的識(shí)別預(yù)測結(jié)果49-50
• 4 miRNA與PRNP基因的靶標(biāo)關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果50-52
• 5 miRNA表達(dá)分析52-54
• 第四部分 總結(jié)與討論54-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 致謝65-67
• 在學(xué)期間獲獎(jiǎng)和發(fā)表論文情況67

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本文編號：788021