本文關鍵詞：microRNAs對黃牛和水牛朊病毒基因轉錄后調控研究

  更多相關文章： 朊病毒疾病 miRNA 轉錄后調控 PRNP 3

【摘要】：朊病毒疾病(Prion diseases)是一類由朊病毒(Prion protein,PrP)引起的致死性神經退行性疾病,又稱為傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathies,TSE)。如牛的瘋牛病、羊的瘙癢癥,以及人的變異型克雅氏癥等。目前普遍認可的致病原因是由于細胞表達的正常型朊蛋白(PrPC),在外界誘因作用下構象發(fā)生改變,形成異常的致病型朊病毒(PrPsc)。其中致病型朊病毒會不斷誘導正常型朊病毒轉變成致病型病毒,進而使致病型病毒在中樞神經系統(tǒng)中迅速積累,最終使疾病爆發(fā)。目前,全球已有近20萬頭的黃牛被報道感染瘋牛病,但是至今沒有水牛感染瘋牛病的報道。我們以往的研究結果顯示,遺傳因素在水牛和黃牛對疾病的易感性上有著不可忽視的作用。我們分析了于疾病傳染性相關的幾個重要組織中朊病毒基因(PRNP)和朊病毒蛋白(PrP)的表達情況,結果顯示：在幾類組織中,黃牛的PrP表達顯著高于水牛。但有趣的是,PRNP mRNA轉錄和PrP翻譯不是同步的,提示在黃牛和水牛中PRNP基因可能受到了復雜的轉錄后調控作用。因此,深入研究PRNP基因的轉錄后調控機制有助于我們進一步認識朊病毒疾病的致病機理。microRNA(miRNA)是轉錄后調控蛋白質表達的重要方式。miRNA在細胞中參與了許多重要生物過程,如發(fā)育、增殖、分化、凋亡等,與生物體的發(fā)育和疾病密切相關。研究發(fā)現miRNA的異常表達與朊病毒疾病的易感性、發(fā)生和發(fā)展密切相關。本研究中,我們從miRNA對靶基因的調控入手,解析了miRNA調控黃牛和水牛PRNP基因轉錄后差異表達的分子機制。首先,通過3'RACE和測序技術,我們注釋了水牛PRNP基因的3'UTR；然后,分析了黃牛和水牛PRNP基因3'UTR的種間固定差異,通過對12頭黃牛和14頭水牛的PRNP基因3'UTR進行全長測序,共檢測到144個種間固定差異位點,包括水牛中UTR-1區(qū)(包含g.67352-67379del→28-bp插入和g.67387-g.67388TG→CC)和UTR-2區(qū)(含有一個AG插入位點,即g.67468de1→A,g.67469del→G)多態(tài)；接下來,擴大樣本量重測序了這兩個區(qū)域,其中UTR-1區(qū)用了162個水牛樣品,194個黃牛樣品重測序,而UTR-2區(qū)用了174個水牛樣品,192個黃牛樣品重測序；結果發(fā)現水牛中UTR-1區(qū)中28-bp插入及兩個堿基替換頻率為80.2%,而UTR-2區(qū)中AG插入頻率為96.0%,但是黃牛均無以上現象；我們用軟件預測到有17個miRNAs可能作用于這兩個區(qū)域。進一步的熒光雙報告實驗證實其中有5個miRNAs具有調控作用,它們是作用于UTR-1的miR-145-5P、miR-328-3P、miR-338-3P和作用于UTR-2的是miR-125b-5P和miR-331-3P:最后,我們采用qPCR的方法檢測了這5個miRNAs在黃牛和水牛腦閂中的表達情況,發(fā)現這5個miRNAs在黃牛和水牛腦閂中均有表達；與其它miRNA相比,miR-125b-5p的表達量在黃牛和水牛中都是最高的；有意思的是,miR-331-3P在水牛腦閂中的含量要顯著高于黃牛。我們推測miR-331-3P調控水牛PRNP基因轉錄后的表達,可能是導致水牛的朊病毒蛋白表達低于黃牛的原因,揭示了黃牛和水牛PNRP基因不同的轉錄后調控機制。本研究從新的視角探討水牛和黃牛朊病毒疾病易感性差異的原因。研究結果將為解析懸而未決的朊病毒疾病致病機理的提供有意義的線索,為朊病毒疾病的治療提供新思路。
【關鍵詞】：朊病毒疾病 miRNA 轉錄后調控 PRNP 3'UTR
【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一部分 背景9-20
• 一、朊病毒疾病的種類9-11
• 1 瘋牛病9-10
• 2 羊瘙癢病10
• 3 貓科動物海綿狀腦病10-11
• 4 變異型克雅氏病11
• 二、朊蛋白基因的研究進展11-15
• 1 PRNP基因的功能及其與朊病毒疾病的關系11-14
• 2 黃牛和水牛PRNP基因轉錄前后表達差異的研究14-15
• 三、MicroRNA與朊病毒疾病15-19
• 1 MicroRNA的產生15-17
• 2 miRNA的特點17
• 3 miRNA與朊病毒疾病的關系17-19
• 四、本研究目的19-20
• 第二部分 實驗材料和方法20-43
• 1 實驗材料20-23
• 1.1 實驗樣品20-21
• 1.2 主要儀器21-22
• 1.3 主要試劑22-23
• 1.4 主要試劑盒23
• 2 實驗方法23-43
• 2.1 用于3'RACE的cDNA的制備23-25
• 2.2 用于miRNA表達量分析的cDNA的制備25-26
• 2.3 3'RACE技術確認水牛PRNP基因3'UTR26-27
• 2.4 產物的回收27-28
• 2.5 測序28-30
• 2.6 DNA提取30-31
• 2.7 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增黃牛和水牛PRNP基因3'UTR31-33
• 2.8 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增PRNP3'UTR區(qū)固定差異位點33-35
• 2.8.1 PCR擴增和測序黃牛和水牛UTR-1區(qū)33-34
• 2.8.2 PCR擴增和測序黃牛和水牛UTR-2區(qū)34-35
• 2.9 克隆35-36
• 2.10 質粒提取36
• 2.11 miRNA的識別預測36
• 2.12 熒光雙報告載體構建36-40
• 2.13 細胞轉染及熒光雙報告檢測40
• 2.14 熒光定量PCR擴增40-42
• 2.15 miRNA相對表達量的計算42-43
• 第三部分 實驗結果43-54
• 1 水牛PRNP基因3'UTR的注釋43-45
• 2 黃牛和水牛PRNP基因3'UTR的擴增和測序結果45-49
• 2.1 PCR擴增和測序結果45-48
• 2.2 檢測UTR-1區(qū)在黃牛和水牛群體中的分布情況48-49
• 2.3 PCR擴增和測序黃牛和水牛UTR-2區(qū)的統(tǒng)計49
• 3 miRNA的識別預測結果49-50
• 4 miRNA與PRNP基因的靶標關系驗證結果50-52
• 5 miRNA表達分析52-54
• 第四部分 總結與討論54-57
• 參考文獻57-65
• 致謝65-67
• 在學期間獲獎和發(fā)表論文情況67

，

本文編號：788021