本文關鍵詞：刺參鹽度相關基因的干擾及功能研究

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【摘要】：刺參(Apostichopus japonicus)是我國重要的名貴海珍產品,隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模不斷的擴大,養(yǎng)殖刺參出現(xiàn)種質資源退化、抗病能力顯著下降以及由水溫和鹽度等因素導致的減產、病害以及生長緩慢等問題。特別是在雨季時,地處江河附近的刺參池塘極易受到降雨影響而導致海水鹽度降低,造成刺參大量的發(fā)病和死亡,給刺參養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經濟損失。本文通過刺參的溶菌酶基因(lysozyme gene,LYZ)、Na+,K+-ATPase基因(Na+,K+-ATPase gene,NKA)及NKCC1基因等的體內RNA干擾試驗,研究其在刺參鹽度適應性狀中的功能,為刺參健康可持續(xù)養(yǎng)殖奠定基礎。(1)本研究中分別構建了溶菌酶基因的Rip-LYZ-1、Rip-LYZ-2、Rip-LYZ-3,Na+,K+-ATPase基因的Rip-NKA-1、Rip-NKA-2、Rip-NKA-3和NKCC1基因的Rip-NKCC-1、Rip-NKCC-2、Rip-NKCC-3 RNA干擾重組質粒。以培養(yǎng)的刺參體腔液原代細胞為靶細胞檢測RNA干擾重組質粒對其靶基因的沉默效率,通過測定其靶基因的相對表達量和酶活性變化來篩選最佳干擾質粒。結果顯示:Rip-LYZ-1、Rip-LYZ-2和Rip-LYZ-3的沉默效率為40%、45%、0%,Rip-NKA-1、Rip-NKA-2和Rip-NKA-3的沉默效率為32%、46%、39%,Rip-NKCC-1、Rip-NKCC-2和Rip-NKCC-3的沉默效率為18%、51%、11%;此外,Rip-LYZ-2和Rip-NKA-2均對其靶基因的表達量和酶活性產生了極為顯著的(P0.01)抑制作用。上述結果為后續(xù)的刺參體內RNA干擾試驗提供了重要的參考依據。(2)為了探索刺參體內RNA干擾的方法,本試驗以Rip-LYZ-2為干擾質粒進行LYZ基因的體內RNA干擾。分別以口腔注射和體腔注射的方式轉染等量的Rip-LYZ-2,48小時后提取刺參體腔液、肌肉和管足組織用于測定各試驗組LYZ基因的表達量變化情況。結果顯示:口腔注射組中,體腔液、肌肉和管足中LYZ基因的相對表達量分別為0.58、0.24和1.6;腹腔注射組中,體腔液、肌肉和管足中LYZ基因的相對表達量分別為1.3、560和0.27。表明從口腔注射RNA干擾重組質粒能夠獲得更為穩(wěn)定的RNA干擾效應和更高的沉默效率。接下來以口腔注射的方式分別注射0.5μg、5μg、10μg和25μg的Rip-LYZ-2。48小時后提取刺參體腔液、肌肉和管足組織用于測定各試驗組LYZ基因的表達變化情況。結果顯示:注射劑量為0.5μg時,刺參體腔液、肌肉和管足LYZ基因的相對表達量分別為1.38、2.69和4.92;注射劑量為5μg時,刺參體腔液、肌肉和管足LYZ基因的相對表達量分別為2.24、0.78和4.55;注射劑量為10μg時,刺參體腔液、肌肉和管足LYZ基因的相對表達量分別為0.08、1.17和0.15;注射劑量為25μg時,刺參體腔液、肌肉和管足LYZ基因的相對表達量分別為0.6、0.13和0.04。表明:當RNA干擾重組質粒的注射劑量達到10μg及以上時,對刺參體內靶基因的表達形成了較為穩(wěn)定的RNA干擾效應。最后,以口腔注射的方式轉染Rip-LYZ-2,并分別在轉染后0 h、12 h、24 h、48 h、4 d和8 d后提取刺參體腔液、肌肉、體壁、疣足和管足組織,對LYZ基因表達量和溶菌酶活性進行測定。結果顯示:體腔液和肌肉中LYZ基因表達量在前48 h呈下降趨勢,之后其表達量快速上升,體腔液中溶菌酶活性則持續(xù)下降,肌肉中溶菌酶活性一開始即上升,而在24 h和48 h未檢測到溶菌酶活性,之后溶菌酶活性快速上升;體壁中LYZ基因表達量及其酶活性的變化趨勢基本一致,總體上呈先上升后下降再上升的趨勢;疣足中LYZ基因表達量及其酶活性在前48 h未出現(xiàn)顯著變化,并分別在48 h達到最小值,之后開始回升;管足中LYZ基因的表達量在12 h顯著上升(P0.05),之后其表達量快速下降,并于48 h后逐步回升,其酶活性一開始即快速上升,在12 h后酶活性持續(xù)下降。表明刺參的RNA干擾效應具有系統(tǒng)性,即局部注射干擾質粒能夠在動物個體的不同組織和器官引起靶基因表達的降低,且mi RNA介導的刺參體內RNA干擾效應能夠持續(xù)四天左右。(3)分別進行低鹽脅迫條件下LYZ、NKA和NKCC1基因的體內RNA干擾實驗。在轉染后0 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h抽取刺參體腔液用于測定基因的表達變化情況。結果顯示:LYZ試驗組的LYZ基因表達量在24 h和72 h時顯著低于對照組(P0.05),而其酶活性在24 h和48 h時亦顯著低于對照組(P0.05),NKA和NKCC1的表達量顯著低于對照組(P0.05);NKA試驗組的NKA基因表達量在12 h和24 h時顯著低于對照組(P0.05),其酶活性在24 h和96 h時顯著低于對照組(P0.05),NKCC1的表達量在12 h到72 h間顯著低于對照組,LYZ的表達量和酶活性在部分時刻亦低于對照組;NKCC試驗組NKCC1和NKA的表達量分別在前48 h和24 h顯著低于對照組;此外,通過測定各對照組和試驗組刺參體腔液中Na+、K+和Cl-的濃度表明:各試驗組刺參體腔液細胞調節(jié)滲透壓的能力降低。進一步驗證了LYZ、NKA和NKCC1基因在刺參鹽度適應中的功能,且這三者之間存在復雜的互作機制。
【關鍵詞】：刺參 RNA干擾 溶菌酶 Na~+ K~+-ATPase NKCC1
【學位授予單位】：大連海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻綜述12-24
• 1.1 研究背景12
• 1.2 海水鹽度對刺參的影響12-14
• 1.2.1 鹽度脅迫對刺參生長發(fā)育、存活率和行為的影響12-13
• 1.2.2 鹽度脅迫對刺參非特異性免疫的影響13-14
• 1.3 鹽度對刺參滲透壓及呼吸代謝的影響14
• 1.4 刺參鹽度相關基因的研究進展14-21
• 1.4.1 溶菌酶的研究14-16
• 1.4.2 Na~+,K~+-ATPase的研究16-19
• 1.4.3 NKCC基因的研究19-21
• 1.5 RNAi的研究進展21-23
• 1.5.1 RNAi的原理21-22
• 1.5.2 RNAi在水產動物研究中的應用22-23
• 1.6 本研究的目的、意義23-24
• 第二章 刺參鹽度相關基因RNA干擾重組質粒的構建及篩選24-40
• 2.1 材料與試劑24-25
• 2.1.1 動物材料24
• 2.1.2 質粒和菌種24
• 2.1.3 培養(yǎng)基和溶液配方24-25
• 2.1.4 其他試驗試劑及器材25
• 2.2 試驗方法25-33
• 2.2.1 RNA干擾重組質粒的構建25-28
• 2.2.2 RNA干擾重組質粒的初篩28-30
• 2.2.3 進一步驗證RNA干擾重組質粒對靶基因的干擾效果30-33
• 2.3 結果與分析33-38
• 2.3.1 RNA干擾重組質粒的鑒定與測序33-35
• 2.3.2 溶菌酶基因RNA干擾重組質粒篩選結果35-36
• 2.3.3 Na~+,K~+-ATPae基因RNA干擾重組質粒篩選結果36-37
• 2.3.4 NKCC1基因RNA干擾重組質粒篩選結果37-38
• 2.4 討論38-40
• 第三章 刺參體內RNA干擾方法的初步研究40-48
• 3.1 材料與試劑40
• 3.1.1 動物材料40
• 3.1.2 質粒和菌種40
• 3.1.3 培養(yǎng)基和溶液配方40
• 3.1.4 實驗試劑及器材40
• 3.2 實驗方法40-42
• 3.2.1 RNA干擾重組質粒的制備40-41
• 3.2.2 從不同部位注射RNA干擾重組質粒41
• 3.2.3 以不同劑量注射RNA干擾重組質粒41
• 3.2.4 測定轉染后不同時間點溶菌酶基因的表達量41-42
• 3.3 結果與分析42-45
• 3.3.1 從不同部位注射Rip-LYZ-2 后溶菌酶基因的表達量變化42-43
• 3.3.2 不同劑量條件下刺參溶菌酶基因的相對表達量43
• 3.3.3 轉染后不同時間點刺參溶菌酶基因的表達量變化43-45
• 3.4 討論45-48
• 第四章 刺參LYZ、NKA和NKCC1基因的體內RNA干擾48-68
• 4.1 材料與試劑48
• 4.1.1 動物材料48
• 4.1.2 質粒和菌種48
• 4.1.3 培養(yǎng)基和溶液配方48
• 4.1.4 試驗試劑和器材48
• 4.2 試驗方法48-52
• 4.2.1 RNA干擾重組質粒的制備48-49
• 4.2.2 RNA干擾重組質粒轉染刺參49
• 4.2.3 檢測轉染后體腔液中靶基因的表達量變化49-50
• 4.2.4 檢測轉染后相關酶活性及離子濃度50-52
• 4.3 結果與分析52-64
• 4.3.1 RNA干擾重組質粒的制備52
• 4.3.2 溶菌酶基因體內RNA干擾結果52-56
• 4.3.3 Na~+,K~+-ATPae基因體內RNA干擾結果56-61
• 4.3.4 NKCC1基因體內RNA干擾結果61-64
• 4.4 討論64-68
• 4.4.1 刺參溶菌酶基因體內RNA干擾結果分析64-65
• 4.4.2 刺參Na~+,K~+-ATPase基因體內RNA干擾結果分析65-66
• 4.4.3 刺參NKCC1基因體內RNA干擾結果分析66-68
• 參考文獻68-82
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文目錄82-88
• 致謝88

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