本文關(guān)鍵詞：Sirt1轉(zhuǎn)基因小鼠下肢缺血后血管新生的初步研究

  更多相關(guān)文章： 血管新生 SIRT1 轉(zhuǎn)基因小鼠 下肢缺血 內(nèi)皮細胞

【摘要】：目的:血管新生是由已存在的血管形成新毛細血管的過程,它可以為機體提供更多的血流,但當其發(fā)生調(diào)節(jié)紊亂時可導(dǎo)致多種疾病的病理過程。有研究證實,哺乳動物沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator1,SIRT1)在血管新生中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本實驗利用Sirt1轉(zhuǎn)基因(Sirt1-transgenic,Sirt1-Tg)小鼠建立下肢股動脈結(jié)扎-缺血模型,對缺血后組織血管新生進行初步研究。方法:1 Sirt1-Tg小鼠飼養(yǎng)、繁殖與仔鼠基因型鑒定隨機選取6~8周齡大小的Sirt1-Tg小鼠,按雌雄比例為2:1進行交配,繁殖仔鼠,取仔鼠鼠耳組織提取基因組DNA,用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)進行基因型鑒定。2股動脈結(jié)扎下肢缺血小鼠模型的復(fù)制隨機選取8周齡成年雄性野生型(wild-type,WT)C57BL/6小鼠(對照組)及Sirt1-Tg小鼠(實驗組)各10只,在固定環(huán)境(室溫24℃,濕度相對恒定)下,異氟烷麻醉小鼠后,先用血流測量儀(Peri Cam PSI)檢測術(shù)前各組小鼠雙下肢血流灌注情況,采用激光散斑對比分析(Laser Speckle Contrast Analysis,LASCA)技術(shù)記錄血流圖像,用PIMSoft(Software Version 1.5)軟件計算左右下肢平均血流的比值。然后在顯微鏡視野內(nèi)結(jié)扎并剪斷左下肢股動脈,手術(shù)結(jié)束后縫合皮膚,再次觀察術(shù)后各組小鼠雙下肢血流狀態(tài)并記錄血流圖像及左右下肢平均血流的比值。3手術(shù)后不同時間點檢測兩組小鼠雙下肢血流灌注情況小鼠在麻醉狀態(tài)下,分別于術(shù)后3天、7天、14天,采用Peri Cam PSI對兩組小鼠雙下肢血流灌注變化情況進行檢測,同時記錄血流圖像及左右下肢平均血流的比值。4免疫組織熒光染色方法檢測CD31(cluster of differentiation 31,CD31)的表達情況術(shù)后14天對兩組小鼠進行血流檢測后,麻醉處死小鼠,分別取兩組小鼠雙下肢腓腸肌,包埋于OCT包埋劑中,并用液氮迅速冷凍后,采用冰凍切片技術(shù)進行組織切片,然后切片行組織免疫熒光染色,利用熒光顯微鏡觀察每組小鼠腓腸肌中CD31的陽性熒光強度。5用western blot(蛋白質(zhì)免疫印跡方法)檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達取術(shù)后14天兩組小鼠腓腸肌組織進行總蛋白提取,用western blot方法檢測組織中VEGF的表達情況。6統(tǒng)計學(xué)處理實驗重復(fù)三次,計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗,以P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1仔鼠基因型鑒定結(jié)果對Sirt1-Tg小鼠交配產(chǎn)生的子代小鼠進行基因型鑒定,PCR擴增產(chǎn)物長度為233 bp,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在250 bp附近可見清晰的條帶。2股動脈結(jié)扎下肢缺血小鼠模型建造成功用LASCA技術(shù)檢測血流結(jié)果顯示,股動脈結(jié)扎術(shù)前兩組小鼠雙下肢血流信號分布均勻,WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠左右下肢平均血流比值分別為0.91±0.07與0.92±0.10(P0.05);術(shù)后,兩組小鼠左下肢結(jié)扎側(cè)的血流信號均明顯減少,甚至消失,WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠雙下肢血流比值分別為0.29±0.05與0.31±0.05(P0.05),術(shù)后與術(shù)前相比,差異明顯(P0.01),提示模型建造成功。3 LASCA技術(shù)血流檢測用LASCA技術(shù)檢測血流結(jié)果顯示,股動脈結(jié)扎術(shù)后3天兩組小鼠左下肢結(jié)扎側(cè)均顯示出微弱的血流信號,WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠雙下肢血流比值分別為0.48±0.05與0.47±0.08(P0.05),提示血管開始新生;術(shù)后7天兩組小鼠左下肢血流均逐漸恢復(fù),WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠雙下肢血流比值分別為0.68±0.05與0.55±0.04(P0.05);術(shù)后14天WT組小鼠左下肢血流接近對側(cè)未結(jié)扎肢體,而Sirt1-Tg組小鼠左下肢血流信號明顯弱于WT組同側(cè)肢體,WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠雙下肢血流比值分別為0.82±0.10與0.66±0.07(P0.01)。4 CD31免疫組織熒光染色冰凍切片免疫組織熒光染色結(jié)果顯示,術(shù)后14天,與右下肢正常側(cè)相比,兩組小鼠左下肢缺血側(cè)腓腸肌組織中CD31熒光表達量均增加,但Sirt1-Tg組小鼠左下肢腓腸肌組織中的CD31熒光密度增加量明顯低于WT組小鼠的增加量,WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠左右下肢腓腸肌的CD31表達量比值分別為1.99±0.17和1.39±0.04(P0.05)。5腓腸肌組織中VEGF表達量Western blot結(jié)果顯示,術(shù)后14天,與右下肢正常側(cè)相比,兩組小鼠左下肢缺血側(cè)腓腸肌組織中VEGF表達量均增加,WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠左右下肢腓腸肌的VEGF表達量比值分別為2.13±0.52和1.24±0.17(P0.05),Sirt1-Tg組小鼠左下肢腓腸肌組織中的VEGF增加量明顯低于WT組小鼠的增加量,結(jié)果與CD31一致。結(jié)論:1 Sirt1-Tg小鼠易于繁殖、飼養(yǎng)。2 Sirt1-Tg小鼠缺血部位的血管新生受抑制。3 SIRT1可能是一種內(nèi)皮細胞增殖抑制因子。
【關(guān)鍵詞】：血管新生 SIRT1 轉(zhuǎn)基因小鼠 下肢缺血 內(nèi)皮細胞
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-20
• 結(jié)果20-22
• 附圖22-27
• 附表27-28
• 討論28-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻32-35
• 綜述 血管新生的研究進展35-51
• 參考文獻44-51
• 致謝51-52
• 個人簡歷52

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