本文關(guān)鍵詞：豬TREM2基因的克隆表達(dá)及針對(duì)豬TREM2胞外區(qū)多克隆抗體的制備

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【摘要】：髓系細(xì)胞觸發(fā)受體作為先天性免疫受體中的一類,在宿主先天性防御中起著相當(dāng)重要的作用,到目前為止,對(duì)豬髓系細(xì)胞觸發(fā)受體的研究還沒有報(bào)導(dǎo),為了深入了解豬髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2的生物學(xué)功能,首先根據(jù)Gen Bank預(yù)測(cè)的豬TREM2(NM_001256777.1)的全基因序列,從豬肺泡巨噬細(xì)胞中提取的RNA為模板擴(kuò)增TREM2的全基因片段,通過測(cè)序驗(yàn)證擴(kuò)增序列的正確性。選取豬TREM2胞外區(qū)基因片段(438 bp)連接到原核表達(dá)載體p ET-28a中,利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了高效表達(dá)于包涵體中的重組TREM2蛋白(約21 k Da)。利用親和層析技術(shù)純化獲得TREM2重組蛋白,以純化的TREM2重組蛋白為免疫原,免疫BALB/c小鼠,每只小鼠免疫約100μg,制備多抗血清,通過Western-Blot證明該多抗血清可以識(shí)別豬源TREM2分子。本研究不僅為進(jìn)一步研究豬TREM2在病原微生物感染中的作用做好鋪墊,而且為揭示豬TREM2在豬呼吸性疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。本研究分為三個(gè)部分:1.豬TREM2基因的克隆與生物信息學(xué)分析隨著TREM2分子在炎癥反應(yīng)中的作用越來越備受關(guān)注,尤其現(xiàn)在豬呼吸道疾病引起的炎癥反應(yīng)在我國(guó)獸醫(yī)臨床中的比例越來越大,其傳播速度快,發(fā)病迅速,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大災(zāi)難。因此,研究豬TREM2分子在豬呼吸道炎癥反應(yīng)中的作用具有極大的前景。本研究根據(jù)Gen Bank預(yù)測(cè)的TREM2(NM_001256777.1)的全基因序列,利用primer5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,然后提取豬肺泡巨噬細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄c DNA作為模板擴(kuò)增TREM2全基因片段,通過測(cè)序驗(yàn)證擴(kuò)增序列的正確性。與Gen Bank中的參考序列及其編碼的氨基酸進(jìn)行比對(duì),同時(shí)將豬TREM2基因的序列分別于人和小鼠的TREM2序列進(jìn)行遺傳的差異性分析,構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,并分析其氨基酸的親水性、跨膜區(qū)及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè),旨在闡明TREM2蛋白抗原表位的分子生物學(xué)特性、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、研制多克隆抗體和建立新型檢測(cè)方法提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.豬TREM2胞外區(qū)原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及純化根據(jù)克隆到的豬TREM2分子及序列生物信息學(xué)分析結(jié)果,選取豬TERM2分子的胞外區(qū)進(jìn)行原核表達(dá),設(shè)計(jì)原核載體表達(dá)引物,將豬TERM2分子的胞外區(qū)連接到表達(dá)載體p ET-28a中。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中,通過對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化,確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況,利用His-Trap鎳離子螯合層析柱將重組蛋白進(jìn)行純化,通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純化情況。結(jié)果顯示在0.4 mmol/L濃度的IPTG中表達(dá)14h可以使蛋白得到大量表達(dá),并且純化成功,為多克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。3.抗豬TREM2多克隆抗體的制備及應(yīng)用將純化得到的重組蛋白與弗氏佐劑按1:1的比例混合乳化,免疫小鼠,免疫量約100μg/只,第四次免疫一周后采血,分離血清得到多克隆抗體。通過Western-Blot證明多克隆抗體的特異性,結(jié)果顯示免疫得到的多克隆抗體不但能與豬源TREM2分子反應(yīng),還可以與真核表達(dá)載體表達(dá)的豬TERM2的全長(zhǎng)反應(yīng)(約31 KDa)。此次制備的抗豬TREM2分子的多克隆抗體為后續(xù)研究豬TREM2分子的功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：髓系細(xì)胞觸發(fā)受體 原核表達(dá) 真核表達(dá) Western-Blot 多克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 符號(hào)說明5-10
• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 1. 引言14-19
• 1.1 豬呼吸道疾病綜合征研究進(jìn)展14-15
• 1.1.1 PRDC發(fā)病原因14
• 1.1.2 PRDC發(fā)病特點(diǎn)14-15
• 1.1.3 PRDC誘發(fā)癥狀15
• 1.1.4 PRDC防制建議15
• 1.2 TREM研究進(jìn)展15-19
• 1.2.1 TREM2基因定位及分子結(jié)構(gòu)16-17
• 1.2.2 TREM2的信號(hào)通路17
• 1.2.3 TREM2對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用17-18
• 1.2.4 TREM2與其他疾病18-19
• 1.3 本研究的內(nèi)容、目的與意義19
• 2. 材料及方法19-36
• 2.1 豬TERM2基因的基因克隆與序列的生物信息學(xué)分析19-21
• 2.1.1 主要儀器19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 試驗(yàn)中所需的溶液及配置方法19-20
• 2.1.4 豬TREM2擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)20
• 2.1.5 豬TREM2基因克隆20-21
• 2.1.6 豬TREM2序列及序列的生物信息學(xué)分析21
• 2.2 豬TREM2原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及純化21-29
• 2.2.1 載體及菌株21
• 2.2.2 主要儀器21-22
• 2.2.3 主要試劑22
• 2.2.4 試驗(yàn)中所需的試劑及配置方法22-23
• 2.2.5 豬TREM2原核表達(dá)引物的設(shè)計(jì)23-24
• 2.2.6 豬TREM2胞外區(qū)基因克隆24-25
• 2.2.7 豬TREM2胞外區(qū)原核表達(dá)載體的構(gòu)建25-27
• 2.2.8 重組菌株的培養(yǎng)27
• 2.2.9 IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)27
• 2.2.10 SDS-PAGE27
• 2.2.11 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化27
• 2.2.12 表達(dá)的重組蛋白的可溶性檢測(cè)27-28
• 2.2.13 重組蛋白的純化及鑒定28-29
• 2.3 多克隆抗體的制備及應(yīng)用29-36
• 2.3.1 試驗(yàn)菌株、載體、動(dòng)物及細(xì)胞29
• 2.3.2 試驗(yàn)中所需的儀器主要儀器29
• 2.3.3 試驗(yàn)所需試劑及溶液的配置方法29-31
• 2.3.4 多克隆抗體的制備31-32
• 2.3.5 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建32-34
• 2.3.6 真核重組質(zhì)粒的大提34
• 2.3.7 CHO細(xì)胞的培養(yǎng)34-35
• 2.3.8 CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染35
• 2.3.9 轉(zhuǎn)染樣品蛋白的處理35-36
• 2.3.10 Western-Blot36
• 3. 結(jié)果與分析36-47
• 3.1 目的基因的克隆及序列的生物信息學(xué)分析36-41
• 3.1.1 基因克隆36-37
• 3.1.2 測(cè)序結(jié)果37-38
• 3.1.3 序列的生物信息學(xué)分析38-41
• 3.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及純化41-44
• 3.2.1 豬TREM2分子胞外區(qū)克隆41
• 3.2.2 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定41-42
• 3.2.3 初步表達(dá)時(shí)間優(yōu)化42
• 3.2.4 IPTG濃度42-43
• 3.2.5 表達(dá)蛋白的可溶性檢測(cè)43
• 3.2.6 蛋白純化43-44
• 3.2.7 Western-Blot44
• 3.3 多克隆抗體的制備及檢測(cè)44-47
• 3.3.1 真核重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定44-45
• 3.3.2 真核表達(dá)質(zhì)粒的Western-Blot結(jié)果45
• 3.3.3 豬肺泡巨噬細(xì)胞的Weatern-Blot結(jié)果45-47
• 4. 討論47-49
• 5. 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 致謝54-55
• 個(gè)人簡(jiǎn)介55-56
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況56

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：769523