本文關鍵詞：豬TREM2基因的克隆表達及針對豬TREM2胞外區(qū)多克隆抗體的制備

  更多相關文章： 髓系細胞觸發(fā)受體 原核表達 真核表達 Western-Blot 多克隆抗體

【摘要】：髓系細胞觸發(fā)受體作為先天性免疫受體中的一類,在宿主先天性防御中起著相當重要的作用,到目前為止,對豬髓系細胞觸發(fā)受體的研究還沒有報導,為了深入了解豬髓系細胞觸發(fā)受體2的生物學功能,首先根據Gen Bank預測的豬TREM2(NM_001256777.1)的全基因序列,從豬肺泡巨噬細胞中提取的RNA為模板擴增TREM2的全基因片段,通過測序驗證擴增序列的正確性。選取豬TREM2胞外區(qū)基因片段(438 bp)連接到原核表達載體p ET-28a中,利用原核表達系統獲得了高效表達于包涵體中的重組TREM2蛋白(約21 k Da)。利用親和層析技術純化獲得TREM2重組蛋白,以純化的TREM2重組蛋白為免疫原,免疫BALB/c小鼠,每只小鼠免疫約100μg,制備多抗血清,通過Western-Blot證明該多抗血清可以識別豬源TREM2分子。本研究不僅為進一步研究豬TREM2在病原微生物感染中的作用做好鋪墊,而且為揭示豬TREM2在豬呼吸性疾病中的作用奠定了基礎。本研究分為三個部分:1.豬TREM2基因的克隆與生物信息學分析隨著TREM2分子在炎癥反應中的作用越來越備受關注,尤其現在豬呼吸道疾病引起的炎癥反應在我國獸醫(yī)臨床中的比例越來越大,其傳播速度快,發(fā)病迅速,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大災難。因此,研究豬TREM2分子在豬呼吸道炎癥反應中的作用具有極大的前景。本研究根據Gen Bank預測的TREM2(NM_001256777.1)的全基因序列,利用primer5.0設計擴增引物,然后提取豬肺泡巨噬細胞RNA,反轉錄c DNA作為模板擴增TREM2全基因片段,通過測序驗證擴增序列的正確性。與Gen Bank中的參考序列及其編碼的氨基酸進行比對,同時將豬TREM2基因的序列分別于人和小鼠的TREM2序列進行遺傳的差異性分析,構建了系統進化樹,并分析其氨基酸的親水性、跨膜區(qū)及B細胞抗原表位預測,旨在闡明TREM2蛋白抗原表位的分子生物學特性、系統進化關系、研制多克隆抗體和建立新型檢測方法提供理論依據和實驗依據。2.豬TREM2胞外區(qū)原核表達載體的構建、表達及純化根據克隆到的豬TREM2分子及序列生物信息學分析結果,選取豬TERM2分子的胞外區(qū)進行原核表達,設計原核載體表達引物,將豬TERM2分子的胞外區(qū)連接到表達載體p ET-28a中。將重組表達載體轉化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中,通過對誘導表達條件的優(yōu)化,確定最佳誘導表達條件。通過SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況,利用His-Trap鎳離子螯合層析柱將重組蛋白進行純化,通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化情況。結果顯示在0.4 mmol/L濃度的IPTG中表達14h可以使蛋白得到大量表達,并且純化成功,為多克隆抗體的制備奠定了基礎。3.抗豬TREM2多克隆抗體的制備及應用將純化得到的重組蛋白與弗氏佐劑按1:1的比例混合乳化,免疫小鼠,免疫量約100μg/只,第四次免疫一周后采血,分離血清得到多克隆抗體。通過Western-Blot證明多克隆抗體的特異性,結果顯示免疫得到的多克隆抗體不但能與豬源TREM2分子反應,還可以與真核表達載體表達的豬TERM2的全長反應(約31 KDa)。此次制備的抗豬TREM2分子的多克隆抗體為后續(xù)研究豬TREM2分子的功能奠定了基礎。
【關鍵詞】：髓系細胞觸發(fā)受體 原核表達 真核表達 Western-Blot 多克隆抗體
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 符號說明5-10
• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 1. 引言14-19
• 1.1 豬呼吸道疾病綜合征研究進展14-15
• 1.1.1 PRDC發(fā)病原因14
• 1.1.2 PRDC發(fā)病特點14-15
• 1.1.3 PRDC誘發(fā)癥狀15
• 1.1.4 PRDC防制建議15
• 1.2 TREM研究進展15-19
• 1.2.1 TREM2基因定位及分子結構16-17
• 1.2.2 TREM2的信號通路17
• 1.2.3 TREM2對炎癥反應的調控作用17-18
• 1.2.4 TREM2與其他疾病18-19
• 1.3 本研究的內容、目的與意義19
• 2. 材料及方法19-36
• 2.1 豬TERM2基因的基因克隆與序列的生物信息學分析19-21
• 2.1.1 主要儀器19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 試驗中所需的溶液及配置方法19-20
• 2.1.4 豬TREM2擴增引物設計20
• 2.1.5 豬TREM2基因克隆20-21
• 2.1.6 豬TREM2序列及序列的生物信息學分析21
• 2.2 豬TREM2原核表達載體的構建、表達及純化21-29
• 2.2.1 載體及菌株21
• 2.2.2 主要儀器21-22
• 2.2.3 主要試劑22
• 2.2.4 試驗中所需的試劑及配置方法22-23
• 2.2.5 豬TREM2原核表達引物的設計23-24
• 2.2.6 豬TREM2胞外區(qū)基因克隆24-25
• 2.2.7 豬TREM2胞外區(qū)原核表達載體的構建25-27
• 2.2.8 重組菌株的培養(yǎng)27
• 2.2.9 IPTG誘導重組菌表達27
• 2.2.10 SDS-PAGE27
• 2.2.11 誘導表達條件的優(yōu)化27
• 2.2.12 表達的重組蛋白的可溶性檢測27-28
• 2.2.13 重組蛋白的純化及鑒定28-29
• 2.3 多克隆抗體的制備及應用29-36
• 2.3.1 試驗菌株、載體、動物及細胞29
• 2.3.2 試驗中所需的儀器主要儀器29
• 2.3.3 試驗所需試劑及溶液的配置方法29-31
• 2.3.4 多克隆抗體的制備31-32
• 2.3.5 真核表達質粒的構建32-34
• 2.3.6 真核重組質粒的大提34
• 2.3.7 CHO細胞的培養(yǎng)34-35
• 2.3.8 CHO細胞的轉染35
• 2.3.9 轉染樣品蛋白的處理35-36
• 2.3.10 Western-Blot36
• 3. 結果與分析36-47
• 3.1 目的基因的克隆及序列的生物信息學分析36-41
• 3.1.1 基因克隆36-37
• 3.1.2 測序結果37-38
• 3.1.3 序列的生物信息學分析38-41
• 3.2 原核表達載體的構建、表達及純化41-44
• 3.2.1 豬TREM2分子胞外區(qū)克隆41
• 3.2.2 原核重組表達質粒的雙酶切鑒定41-42
• 3.2.3 初步表達時間優(yōu)化42
• 3.2.4 IPTG濃度42-43
• 3.2.5 表達蛋白的可溶性檢測43
• 3.2.6 蛋白純化43-44
• 3.2.7 Western-Blot44
• 3.3 多克隆抗體的制備及檢測44-47
• 3.3.1 真核重組質粒的雙酶切鑒定44-45
• 3.3.2 真核表達質粒的Western-Blot結果45
• 3.3.3 豬肺泡巨噬細胞的Weatern-Blot結果45-47
• 4. 討論47-49
• 5. 結論49-50
• 參考文獻50-54
• 致謝54-55
• 個人簡介55-56
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況56

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前6條

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本文編號：769523