本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)漆酶菌株的篩選及漆酶基因的克隆表達(dá)

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【摘要】：秸稈等有機(jī)農(nóng)業(yè)廢棄物主要成分是木質(zhì)素、纖維素和半纖維素,利用秸稈的關(guān)鍵就是降解包裹在纖維素和半纖維素外面的木質(zhì)素。漆酶(EC 1.10.3.2)底物范圍十分廣泛,可以催化酚類、芳胺類和木質(zhì)素等化合物,在環(huán)境治理、食品工業(yè)和木質(zhì)素降解等方面都有廣闊的應(yīng)用前景。漆酶的生產(chǎn)主要來源于微生物發(fā)酵,但其發(fā)酵周期長,酶穩(wěn)定性差,因此,本研究通過基因工程的手段進(jìn)行漆酶基因的克隆,并進(jìn)行異源表達(dá)來提高酶活力及產(chǎn)量,增加酶的穩(wěn)定性主要研究結(jié)果如下：從土壤及腐敗樹木上分離到16株產(chǎn)漆酶細(xì)菌和6株產(chǎn)漆酶真菌,通過比較酶活力,確定1株漆酶活力較高的細(xì)菌QM11和1株漆酶活力較高的真菌Z6,在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中酶活力分別達(dá)到了4.36 U/L和62.78 U/mL。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和細(xì)菌16S rDNA保守區(qū)的基因測序分析,初步鑒定QM11細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察,真菌ITS-rDNA保守區(qū)的基因測序分析,初步鑒定Z6真菌為變色栓菌(Trametes versicolor)。通過特異性引物進(jìn)行QM11菌株及Z6菌株漆酶基因的克隆,得到細(xì)菌漆酶cotA基因長度為1542 bp,編碼513個(gè)氨基酸,cotA蛋白相對分子量約為58 kDa,理論等電點(diǎn)為5.91。真菌漆酶lac1基因長度為1560 bp,編碼519個(gè)氨基酸,lacl蛋白相對分子量為56 kDa,理論等電點(diǎn)為5.87。將變色栓菌Z6的漆酶lacl基因構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC9K-lac1,并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中,構(gòu)建重組表達(dá)菌株P(guān). pastoris GS115/pPIC9K-lac1,隨后進(jìn)行重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果在BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)72 h后出現(xiàn)酶活,最高達(dá)到了5.44 U/L。將枯草芽孢桿菌QM11的漆酶cotA基因構(gòu)建原核表達(dá)載體pET22b-cotA,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,構(gòu)建重組表達(dá)菌株E.coli BL21/pET22b-cotA,并在16℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示實(shí)際分子量為70 kDa左右。隨后將cotA蛋白通過Ni-NTA進(jìn)行純化,純化后的重組cotA蛋白的比活力為136.73 U/mg,純化倍數(shù)為7.83倍,回收率為40.29%。對純化后的cotA蛋白進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究,鄉(xiāng)結(jié)果顯示重組cotA蛋白的最適pH值為3,在pH 2-4的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好,剩余酶活力均達(dá)到70%以上。重組cotA蛋白的最適溫度為70℃,在60℃-80℃范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性良好,80℃處理1h后仍有40%左右的酶活力。在每種離子濃度為1 mmol/L的環(huán)境中,Fe3+及Cu2+可顯著提高重組cotA蛋白活性,分別提高了2.7倍和4.5倍,Fe2+強(qiáng)烈抑制cotA蛋白的活性,使cotA蛋白活性只有初始活力的17.26%,Ca2+及C02+對重組cotA蛋白的活性幾乎無影響。以2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)為底物對重組cotA的動力學(xué)常數(shù)進(jìn)行測定,經(jīng)過計(jì)算得到Km=0.48 mmo1-L-1,Vmax=0.448 mmol·L-1·min-1。
【關(guān)鍵詞】：枯草芽孢桿菌 變色栓菌 漆酶 基因克隆 異源表達(dá) 酶學(xué)性質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;TQ925
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 1 緒論11-18
• 1.1 漆酶的特征及結(jié)構(gòu)11-12
• 1.1.1 漆酶的來源11
• 1.1.2 微生物漆酶的理化特征11
• 1.1.3 微生物漆酶的結(jié)構(gòu)11-12
• 1.2 常用基因異源表達(dá)系統(tǒng)12-14
• 1.2.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)12-13
• 1.2.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)13-14
• 1.3 漆酶基因克隆表達(dá)的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀14-15
• 1.4 漆酶的應(yīng)用進(jìn)展15-16
• 1.4.1 環(huán)境治理15-16
• 1.4.2 食品工業(yè)中的應(yīng)用16
• 1.4.3 造紙工業(yè)16
• 1.4.4 農(nóng)業(yè)16
• 1.5 本研究的目的及意義16-17
• 1.6 課題的研究內(nèi)容17-18
• 2 產(chǎn)漆酶菌株的篩選及鑒定18-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器18-19
• 2.1.1 主要試劑18
• 2.1.2 儀器與設(shè)備18-19
• 2.1.3 培養(yǎng)基19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-22
• 2.2.1 樣品采集19
• 2.2.2 產(chǎn)漆酶菌株的分離及初篩19
• 2.2.3 產(chǎn)漆酶菌株的復(fù)篩19
• 2.2.4 漆酶的酶活測定方法19-20
• 2.2.5 細(xì)菌形態(tài)觀察及生理生化鑒定20
• 2.2.6 真菌菌落形態(tài)觀察20
• 2.2.7 產(chǎn)漆酶細(xì)菌的16SrDNA分子生物學(xué)鑒定20-22
• 2.2.8 產(chǎn)漆酶真菌的rDNA-ITS序列分子生物學(xué)鑒定22
• 2.2.9 基因序列測定及序列分析22
• 2.3 結(jié)果與分析22-29
• 2.3.1 產(chǎn)漆酶細(xì)菌的分離與初步篩選22-23
• 2.3.2 產(chǎn)漆酶真菌的分離與初篩23
• 2.3.3 產(chǎn)漆酶菌種的酶活力復(fù)篩23-24
• 2.3.4 產(chǎn)漆酶細(xì)菌的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定24-25
• 2.3.5 QM11的分子生物學(xué)鑒定25-27
• 2.3.6 真菌Z6的鑒定27-29
• 2.4 本章小結(jié)29-30
• 3 QM11及Z6漆酶基因的克隆及序列分析30-46
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器30-31
• 3.1.1 菌種及載體30
• 3.1.2 主要試劑30
• 3.1.3 儀器與設(shè)備30
• 3.1.4 培養(yǎng)基30-31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 3.2.1 QM11菌株漆酶cotA基因的克隆31-32
• 3.2.2 Z6菌株漆酶lac1基因的克隆32-34
• 3.2.3 cotA,lac1基因的序列分析34
• 3.3 結(jié)果與分析34-45
• 3.3.1 QM11菌株基因組DNA的提取及其cotA基因的擴(kuò)增34-35
• 3.3.2 重組克隆質(zhì)粒pMD18T-cotA的構(gòu)建35
• 3.3.3 cotA基因的序列分析35-39
• 3.3.4 Z6總RNA的提取及l(fā)ac1基因的擴(kuò)增39-40
• 3.3.5 重組克隆載體pMD18T-lac1的構(gòu)建40-41
• 3.3.6 lac1基因的序列分析41-45
• 3.4 本章小結(jié)45-46
• 4 cotA基因及l(fā)ac1基因的異源表達(dá)46-56
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器46-47
• 4.1.1 菌種與質(zhì)粒46
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑46-47
• 4.1.3 儀器與設(shè)備47
• 4.1.4 培養(yǎng)基47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-51
• 4.2.1 pET22b-cotA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定47-48
• 4.2.2 cotA基因重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)48-49
• 4.2.3 SDS-PAGE電泳檢測49
• 4.2.4 pPIC9K-lac1表達(dá)載體的構(gòu)建49-50
• 4.2.5 畢赤酵母感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化50-51
• 4.2.6 酵母表型的篩選及PCR鑒定51
• 4.2.7 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)51
• 4.3 結(jié)果與分析51-55
• 4.3.1 重組質(zhì)粒pET22b-cotA的構(gòu)建及鑒定51-52
• 4.3.2 cotA基因的誘導(dǎo)表達(dá)52-53
• 4.3.3 重組質(zhì)粒pPIC9K-lac1的構(gòu)建和鑒定53
• 4.3.4 酵母的電轉(zhuǎn)化及重組子的篩選53-54
• 4.3.5 lac1基因的誘導(dǎo)表達(dá)及活性檢測54-55
• 4.4 本章小結(jié)55-56
• 5 重組漆酶cotA蛋白的純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究56-65
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器56-57
• 5.1.1 菌種56
• 5.1.2 主要試劑56
• 5.1.3 儀器與設(shè)備56
• 5.1.4 重組蛋白純化所用溶液56-57
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法57-59
• 5.2.1 誘導(dǎo)溫度的選擇57
• 5.2.2 粗酶液的制備57
• 5.2.3 鎳柱親和柱層析純化57
• 5.2.4 SDS-PAGE電泳分析57
• 5.2.5 重組cotA蛋白濃度的測定57-58
• 5.2.6 純化倍數(shù)及回收率的計(jì)算58
• 5.2.7 重組漆酶cotA蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究58-59
• 5.3 結(jié)果與分析59-64
• 5.3.1 誘導(dǎo)時(shí)間的確定59
• 5.3.2 cotA蛋白的分離純化59-61
• 5.3.3 cotA蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究61-64
• 5.4 本章小結(jié)64-65
• 結(jié)論65-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文72-73
• 致謝73

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