本文關(guān)鍵詞：甘草離體培養(yǎng)條件優(yōu)化及轉(zhuǎn)HMGR、SQS1、β-AS基因毛狀根培養(yǎng)體系的構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： 甘草 甘草酸 再生植株 原生質(zhì)體 毛狀根 根特異性過表達 HMGR SQS1 β-AS

【摘要】：甘草是我國最常用的大宗藥材之一,具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調(diào)和諸藥等作用。但是近些年來人工栽培甘草的質(zhì)量差異較大,存在著品質(zhì)退化和甘草酸含量低等問題,難以達到《中國藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。為了解決甘草資源可持續(xù)發(fā)展以及甘草酸藥源匱乏等問題,甘草組織培養(yǎng)的相關(guān)研究受到了越來越多的重視。本論文試圖從甘草再生植株、原生質(zhì)體以及毛狀根三個方面對甘草的離體培養(yǎng)進行研究,通過確定最佳的甘草再生植株誘導(dǎo)方案、甘草原生質(zhì)體分離條件以及甘草毛狀根誘導(dǎo)條件來建立完整的甘草組織培養(yǎng)體系,以期為基因工程研究及代謝工程研究奠定基礎(chǔ)。此外,在確定了最佳甘草毛狀根誘導(dǎo)條件的基礎(chǔ)上,本論文進一步嘗試了轉(zhuǎn)基因甘草毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng),以甘草酸代謝途徑上的三個關(guān)鍵酶基因：3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)基因、鯊稀合成酶(squalene synthetase,SQS)基因以及β-香樹脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因為目標(biāo)基因,誘導(dǎo)根特異性過表達HMGR、SQS1、β-AS基因的甘草毛狀根,不僅為進一步揭示甘草酸合成途徑的分子調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ),也為離體條件下提高甘草酸的積累水平奠定研究基礎(chǔ)。本論文共取得了如下研究結(jié)果：(1)建立了最佳的甘草離體培養(yǎng)再生體系,即：誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6.BA 0.5 mg·L-1 +2,4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1)、分化培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1)及生根培養(yǎng)基(1/2MS+IAA 0.6mg·L-1)。(2)確定了最佳的甘草原生質(zhì)體分離條件,即：以生長7 d甘草無菌苗的子葉為外植體材料,在4℃條件下于MS基本培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)12 h；以含有0.7 mol·L-1甘露醇作為滲透保護劑的CPW溶液進行酶液(1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶)的配制；在25℃條件下靜置酶解14 h。(3)從是否預(yù)培養(yǎng)、是否添加AS、外植體來源以及培養(yǎng)基類型4個方面對甘草毛狀根的誘導(dǎo)條件進行了研究,并確定了最佳的誘導(dǎo)方案,即：以甘草胚軸為外植體,以6,7-V培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,且無需預(yù)培養(yǎng),無需添加AS。(4)成功構(gòu)建了根特異性過表達HMGR、SQS1、β-AS基因發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌并成功誘導(dǎo)得到根特異性過表達HMGR、SQS1、α-AS基因甘草毛狀根。(5)利用Real time PCR檢測了11份根特異性過表達HMGR、SQS1、β-AS基因甘草毛狀根中各外源基因拷貝數(shù),結(jié)果顯示過表達ê-AS基因毛狀根中ê-AS基因拷貝數(shù)為3、4或7個,過表達HMGR基因毛狀根中HMGR基因拷貝數(shù)為3或5個,過表達SQS1基因毛狀根中SQS1基因拷貝數(shù)為5或6個。(6)利用HPLC檢測了35份毛狀根樣品,其中24份空白毛狀根以及全部的根特異性過表達HMGR及SQS1基因毛狀根樣品中均未檢出甘草酸,僅在3份根特異性過表達ê-AS基因的毛狀根B1、B2及B3中檢出甘草酸,從而證實了ê-AS基因相比于HMGR、 SQS1基因?qū)Ω什菟岷铣傻挠绊懜鼮橹苯印?br/> 【關(guān)鍵詞】：甘草 甘草酸 再生植株 原生質(zhì)體 毛狀根 根特異性過表達 HMGR SQS1 β-AS
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S567.71
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 英文縮略語10-11
• 前言11-15
• 1 立題依據(jù)11-12
• 1.1 栽培甘草品質(zhì)降低成為制約甘草資源可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問題11
• 1.2 甘草組織培養(yǎng)技術(shù)有利于解決甘草資源可持續(xù)發(fā)展這一瓶頸問題11
• 1.3 毛狀根在次生代謝產(chǎn)物合成方面具有重要價值11
• 1.4 功能基因?qū)Ω什菟嵘锖铣删哂忻鞔_的影響11-12
• 2 研究思路與方法12-15
• 2.1 研究目標(biāo)12
• 2.2 研究內(nèi)容12-14
• 2.3 技術(shù)路線14-15
• 第一章 文獻綜述15-21
• 1 甘草離體培養(yǎng)研究進展15-19
• 1.1 外植體材料15-16
• 1.2 愈傷組織誘導(dǎo)16
• 1.3 再生植株誘導(dǎo)16-17
• 1.4 原生質(zhì)體培養(yǎng)17-18
• 1.5 甘草毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)18-19
• 2 甘草酸代謝途徑功能基因的研究概況19-21
• 2.1 3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因20
• 2.2 鯊烯合酶基因20
• 2.3 β-香樹脂醇合成酶基因20-21
• 第二章 甘草離體培養(yǎng)再生體系的建立21-31
• 1 材料與方法21-26
• 1.1 實驗材料21-24
• 1.2 甘草外植體材料制備24
• 1.3 甘草愈傷組織誘導(dǎo)24-25
• 1.4 分化培養(yǎng)25
• 1.5 生根培養(yǎng)25
• 1.6 甘草再生植株煉苗及移栽25-26
• 2 結(jié)果26-30
• 2.1 甘草外植體制備26-27
• 2.2 甘草愈傷組織誘導(dǎo)27-28
• 2.3 甘草再生植株誘導(dǎo)28-29
• 2.4 甘草再生植株煉苗及移栽29-30
• 3 小結(jié)與討論30-31
• 第三章 甘草原生質(zhì)體分離條件優(yōu)化31-37
• 1 材料與方法31-34
• 1.1 實驗材料31-32
• 1.2 不同酶液組合及外植體材料對甘草原生質(zhì)體分離的影響32-33
• 1.3 不同酶解時間以及酶解方式對甘草原生質(zhì)體分離的影響33
• 1.4 不同低溫預(yù)處理方法對甘草原生質(zhì)體分離的影響33
• 1.5 不同滲透壓對甘草原生質(zhì)體分離的影響33-34
• 1.6 甘草原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的計算方法34
• 2 結(jié)果34-36
• 2.1 不同酶液組合及供試材料處理結(jié)果34
• 2.2 不同酶解時間以及酶解方式對甘草原生質(zhì)體分離的影響34-35
• 2.3 不同低溫預(yù)處理方法對甘草原生質(zhì)體分離的影響35-36
• 2.4 不同滲透壓對甘草原生質(zhì)體分離的影響36
• 3 小結(jié)與討論36-37
• 第四章 甘草毛狀根誘導(dǎo)條件優(yōu)化37-46
• 1 材料與方法37-41
• 1.1 實驗材料37-39
• 1.2 發(fā)根農(nóng)桿菌的活化39
• 1.3 甘草外植體材料制備39
• 1.4 毛狀根誘導(dǎo)條件變量設(shè)計39
• 1.5 侵染、共培養(yǎng)及除菌39-40
• 1.6 甘草毛狀根的PCR驗證及測序驗證40-41
• 2 結(jié)果41-45
• 2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌的活化41
• 2.2 各實驗組毛狀根誘導(dǎo)情況比較41-44
• 2.3 毛狀根PCR驗證及測序驗證結(jié)果44-45
• 3 小結(jié)與討論45-46
• 3.1 小結(jié)45
• 3.2 討論45-46
• 第五章 甘草根特異性過表達HMGR、SQS1、β-AS基因毛狀根的誘導(dǎo)與分析46-71
• 1 材料與方法46-55
• 1.1 實驗材料46-47
• 1.2 根特異性過表達HMGR、SQS1、β-AS基因發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的構(gòu)建47-50
• 1.3 甘草根特異性過表達HMGR、SQS1、β-AS基因毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)50-51
• 1.4 根特異性過表達HMGR、SQS1、β-AS基因甘草毛狀根中各目的基因拷貝數(shù)測定51-54
• 1.5 HPLC法測定轉(zhuǎn)基因甘草毛狀根中甘草酸含量54-55
• 2 結(jié)果55-69
• 2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌PCR及測序驗證結(jié)果55-57
• 2.2 甘草根特異性過表達HMGR、SQS1、β-AS基因毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)57-61
• 2.3 根特異性過表達HMGR、SQS1、β-AS基因毛狀根中各外源基因拷貝數(shù)測定結(jié)果61-68
• 2.4 HPLC測定甘草毛狀根中甘草酸含量結(jié)果68-69
• 3 小結(jié)與討論69-71
• 3.1 小結(jié)69-70
• 3.2 討論70-71
• 第六章 總結(jié)與展望71-73
• 1 總結(jié)71-72
• 2 展望72-73
• 參考文獻73-78
• 致謝78-79
• 在學(xué)期間主要研究成果79

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