本文關(guān)鍵詞：不同啟動子驅(qū)動DR1172轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的抗旱性研究

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【摘要】：干旱是植物生長發(fā)育過程中影響最大的非生物脅迫因素之一,它嚴(yán)重制約了全球農(nóng)業(yè)的發(fā)展。目前,對植物的抗旱機(jī)理,以及培育具有抗旱的轉(zhuǎn)基因新品種成為研究的熱點(diǎn)。甘藍(lán)型油菜,屬于十字花科蕓薹屬,是植物蛋白和植物油主要來源之一。在我國,因干旱導(dǎo)致油菜年產(chǎn)量損失達(dá)20%以上。近來,利用基因工程技術(shù),通過轉(zhuǎn)入外源過表達(dá)基因來提高油菜的抗逆能力已經(jīng)取得一定的成效,而增加的油菜抗逆功能的同時,又不影響油菜的品質(zhì)和產(chǎn)量也受到了更多的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn),分別構(gòu)建CaMV35S和At PUB19啟動子驅(qū)動的DR1172基因的植物表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中,從而研究不同啟動子對轉(zhuǎn)DR1172基因甘藍(lán)型油菜的抗旱性能力的影響,以及對轉(zhuǎn)基因油菜生理生化造成的差異,最終篩選出綜合性狀良好的油菜新品種。目前,取得的成果如下:(1)分別構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCambia-At PUB19::DR1172和PBI121-CaMV35S::DR1172,并成功轉(zhuǎn)化EHA105感受態(tài)細(xì)胞。(2)通過使用分析軟件,發(fā)現(xiàn)AtPUB19啟動子順式作用元件上含有與干旱、脫水相關(guān)應(yīng)答的元件、啟動子和增強(qiáng)子的保守元件、啟動子的核心保守序列,以及預(yù)測的兩個轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。(3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將EHA105中的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中,通過PCR檢測,發(fā)現(xiàn)含有pCambia-At PUB19::DR1172的轉(zhuǎn)基因植物78株和含有PBI121-CaMV35S::DR1172的轉(zhuǎn)基因植物46株。(4)采用PEG6000模擬干旱實(shí)驗(yàn)處理的方法,分別對T1代種子(非轉(zhuǎn)基、轉(zhuǎn)At PUB19::DR1172、轉(zhuǎn)CaMV35S::DR1172)進(jìn)行不同PEG濃度的脅迫處理實(shí)驗(yàn),以及20%PEG濃度下不同時間的脅迫處理實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,在不同干旱情況下,CaMV35S和AtPUB19啟動子都可有效的驅(qū)動DR1172基因的表達(dá),但高度干旱脅迫時,與CaMV35S啟動子相比較,AtPUB19啟動子可更高效的驅(qū)動DR1172基因的表達(dá),且顯著提高油菜葉片的抗氧化酶活性。在不同時間的干旱脅迫后,轉(zhuǎn)CaMV35S::DR1172基因組和轉(zhuǎn)AtPUB19::DR1172基因組油菜葉片的抗氧化酶活性呈現(xiàn)上升趨勢,而非轉(zhuǎn)基因組呈先上升再下降的趨勢。同時,CaMV35S啟動子和AtPUB19啟動子可驅(qū)動DR1172基因可緩解MDA對植物組織造成的傷害。AtPUB19啟動子驅(qū)動的DR1172基因也減緩了葉綠素含量、相對含水量的降低速率,相對電導(dǎo)率的增加速率,以及提高了脯氨酸含量和可溶性糖含量,降低了干旱對植物造成的損失程度。(5)實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明,隨著干旱脅迫時間的持續(xù)性增加,CaMV35S啟動子驅(qū)動DR1172基因在油菜葉片中的相對表達(dá)量維持在一個較低的水平,而AtPUB19啟動子驅(qū)動的DR1172基因組在油菜葉片中的相對表達(dá)量隨著干旱時間的增加而呈現(xiàn)較高的水平。(6)根據(jù)20%PEG處理不同時期的油菜葉片,其形態(tài)特征變化顯示,高度干旱脅迫可提高At PUB19啟動子驅(qū)動DR1172基因的抗旱水平,且高于CaMV35S啟動能力。說明了CaMV35S驅(qū)動的基因在油菜表達(dá)中不具有時間特異性和組織特異性,而AtPUB19可根據(jù)植物不同的發(fā)育階段和生長環(huán)境,對外源基因的表達(dá)進(jìn)行定時、定點(diǎn)、定量的誘導(dǎo)表達(dá),從而緩解干旱對其形狀和品質(zhì)的不良影響。
【關(guān)鍵詞】：AtPUB19 CaMV35S DR1172 甘藍(lán)型油菜 干旱
【學(xué)位授予單位】：西南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S565.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 緒論12-27
• 1.1 植物抗旱性研究12-19
• 1.1.1 干旱對植物的影響12-13
• 1.1.2 植物抗干旱生理機(jī)制13-15
• 1.1.3 植物抗干旱分子機(jī)制15-19
• 1.2 調(diào)控基因表達(dá)的啟動子研究進(jìn)展19-22
• 1.2.1 組成型啟動子19
• 1.2.2 組織特異型啟動子19-20
• 1.2.3 誘導(dǎo)型啟動子20-22
• 1.3 AtPUB19啟動子與DR1172基因22-23
• 1.3.1 AtPUB19啟動子22
• 1.3.2 DR1172基因22-23
• 1.4 研究目的和意義23-25
• 1.5 技術(shù)路線25-27
• 2 兩種植物表達(dá)載體的構(gòu)建以及AtPUB19啟動子的生物信息學(xué)分析27-44
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 菌種27
• 2.1.2 菌用培養(yǎng)基27
• 2.1.3 試劑27
• 2.1.4 儀器和設(shè)備27-28
• 2.1.5 主要緩沖液28
• 2.2 方法28-35
• 2.2.1 構(gòu)建植物表達(dá)載體PBI121-CaMV35S::DR1172和pCambia-AtPUB19::DR117228-30
• 2.2.2 大腸桿菌的活化30
• 2.2.3 載體片段的獲取30-31
• 2.2.4 DR1172基因目的片段的獲取31-32
• 2.2.5 DR1172基因與線性載體的重組連接32-33
• 2.2.6 感受態(tài)細(xì)胞的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化33-35
• 2.2.7 AtPUB19啟動子的生物信息學(xué)分析35
• 2.3 結(jié)果與分析35-42
• 2.3.1 大腸桿菌的活化35-36
• 2.3.2 載體片段的獲取36-37
• 2.3.3 DR1172基因目的片段的獲取37-38
• 2.3.4 植物表達(dá)載體的重組連接和轉(zhuǎn)化38-40
• 2.3.5 AtPUB19啟動子的生物信息學(xué)分析40-42
• 2.4 討論42-44
• 3 轉(zhuǎn)基因陽性苗的獲得44-58
• 3.1 材料44-45
• 3.1.1 植物材料44
• 3.1.2 植物培養(yǎng)基44-45
• 3.1.3 試劑45
• 3.2 方法45-48
• 3.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)油菜的遺傳轉(zhuǎn)化45-47
• 3.2.2 轉(zhuǎn)基因油菜苗的PCR檢測47-48
• 3.3 結(jié)果與分析48-54
• 3.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲取轉(zhuǎn)基因油菜48-53
• 3.3.2 轉(zhuǎn)基因油菜苗的PCR檢測53-54
• 3.4 討論54-58
• 3.4.1 褐化現(xiàn)象54-55
• 3.4.2 白化現(xiàn)象55-56
• 3.4.3 玻璃化現(xiàn)象56-57
• 3.4.4 畸形現(xiàn)象57-58
• 4 不同啟動子驅(qū)動DR1172轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的抗旱性研究58-82
• 4.1 材料58
• 4.1.1 植物材料58
• 4.1.2 試劑58
• 4.2 方法58-63
• 4.2.1 植物的培養(yǎng)和脅迫過程58-59
• 4.2.2 生理指標(biāo)的測定與方法59-60
• 4.2.3 油菜葉片中CaMV35S::DR1172基因與AtPUB19::DR1172基因在干旱脅迫下相對表達(dá)量的檢測60-63
• 4.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析63
• 4.3 結(jié)果與分析63-78
• 4.3.1 干旱脅迫下油菜葉片中葉綠素的變化63-65
• 4.3.2 干旱脅迫下油菜葉片中抗氧化酶活性的變化65-68
• 4.3.3 干旱脅迫下油菜葉片中相對含水量的變化68-69
• 4.3.4 干旱脅迫下油菜葉片中相對電導(dǎo)率的變化69-70
• 4.3.5 干旱脅迫下油菜葉片中可溶性糖的變化70-72
• 4.3.6 干旱脅迫下油菜葉片中丙二醛的變化72-73
• 4.3.7 干旱脅迫下油菜葉片中脯氨酸含量的變化73-74
• 4.3.8 干旱脅迫下不同啟動子驅(qū)動的DR1172基因在甘藍(lán)型油菜葉片 中的表達(dá)量74-75
• 4.3.9 植株形態(tài)特征的變化75-78
• 4.4 討論78-82
• 4.4.1 不同啟動子驅(qū)動的DR1172基因?qū)Ω仕{(lán)型油菜葉片中生理生化指標(biāo)的影響78-81
• 4.4.2 不同啟動子驅(qū)動的DR1172基因在甘藍(lán)型油菜葉片中的表達(dá)情況分析81-82
• 結(jié)論82-85
• 致謝85-86
• 參考文獻(xiàn)86-99
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的與學(xué)位論文相關(guān)的學(xué)術(shù)論文及研究成果99-100
• 附錄 1100

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本文編號：752374