本文關(guān)鍵詞：胸膜肺炎放線桿菌potD2基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究

  更多相關(guān)文章： 胸膜肺炎放線桿菌 多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 基因敲除 生物特性 壓力耐受

【摘要】：胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一類引起豬傳染性胸膜肺炎的病原微生物。potABCD多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)普遍存在于各類原核細(xì)菌,其中PotD屬于一種底物結(jié)合蛋白,能特異性識(shí)別并結(jié)合多胺,參與多胺胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)；在一些細(xì)菌中potD基因突變,將誘導(dǎo)細(xì)菌一系列生理功能以及致病性的改變；APP基因組中也存在假定的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因potD2,為探究該基因?qū)PP某些生物特性及毒力的影響,本研究首先以眉山豬場感染豬群分離的I型APP野毒株MS0721為母體,通過同源重組的原理構(gòu)建potD2基因缺失株及其突變回復(fù)株,并探究突變株生物學(xué)特性的改變,主要內(nèi)容如下：1、MSΔpotD2缺失株及其互補(bǔ)株C ΔpotD2的構(gòu)建與鑒定參考NCBI已公布的APP1型4074基因組序列,以親本株MS0721基因組為模板,設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增目的基因potD2的上下游序列同源臂；經(jīng)兩步法重疊延伸PCR,將左右同源臂融合后與自殺性質(zhì)粒pEMOC2定向連接,PCR、酶切及測序分析鑒定正確,成功構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pEMOC2-ApotD2。將重組自殺性質(zhì)粒pEMOC2-ApotD2轉(zhuǎn)化到供體菌β2155感受態(tài),利用親本株濾膜雜交的方法與APP MS0721共同培養(yǎng),質(zhì)粒pEMOC2-ΔpotD2通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入受體APP,通過正向篩選出氯霉素抗性、蔗糖敏感菌落,并PCR鑒定為整合了重組質(zhì)粒的一次單交換菌株。隨機(jī)挑選上述一次重組菌落,經(jīng)傳代培養(yǎng)后負(fù)向篩選出對蔗糖不敏感、無氯霉素抗性的雙交換重組菌落,最終PCR鑒定成功篩選出4株potD2基因缺失突變株。同理參考4074基因組序列,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增potD2整個(gè)閱讀表達(dá)框架,酶切后與穿梭質(zhì)粒PLS88定向連接,構(gòu)建穿梭互補(bǔ)質(zhì)粒pLS88-potD2, PCR及酶切鑒定正確,插入目的基因測序分析無堿基突變。利用電轉(zhuǎn)法將互補(bǔ)質(zhì)粒pLS88-potD2導(dǎo)入APPMSApotD2缺失株感受,并涂布于卡那抗性的TSA培養(yǎng)基,進(jìn)而獲得具有卡那抗性APP菌落,最后通過PCR鑒定,成功獲得互補(bǔ)株C ΔpotD2。最后進(jìn)行western blot鑒定結(jié)果顯示,MS0721和互補(bǔ)株菌體變性蛋白中分離出目的蛋白條帶約37KD,而MSΔpotD2突變株中無此目的條帶,由此可見,potD2基因在突變株中不能表達(dá),基因敲除成功,而在互補(bǔ)株中正常表達(dá)也說明互補(bǔ)株的成功構(gòu)建。2、MSΔpotD2生物學(xué)特性及其小鼠毒力試驗(yàn)研究檢測MSΔpotD2及互補(bǔ)株的穩(wěn)定性表明MSΔpotD2和CΔpotD2傳10代培養(yǎng),每代均能正常生長繁殖,且potD2基因敲除后無回復(fù)突變,互補(bǔ)質(zhì)粒也穩(wěn)定存在。生長特性研究發(fā)現(xiàn),MSΔpotD2缺失株在對數(shù)生長前期低于親本株和互補(bǔ)株,然而幾乎同時(shí)到達(dá)同一穩(wěn)定平臺(tái)期,這表明potD2基因的敲除僅對細(xì)菌生長活性無明顯影響。菌液接種于含5%新鮮山羊血的TSA培養(yǎng)基,觀察溶血情況表明三株菌株都具有完全溶血的活性,而MSΔpotD2溶血直徑略低于MS0721及CΔpotD2。分別使用96孔培養(yǎng)法和試管培養(yǎng)法檢測生物被膜的生成,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三株菌株都不能形成生物膜,推測可能有細(xì)菌血清型有關(guān)。取對數(shù)生長期菌液MS0721、 MSΔpotD2及CΔpotD2稀釋后于含0.3M KCl和NaCl的TSA平板中過夜培養(yǎng),通過存活率比較來評估potD2基因?qū)?xì)菌耐高滲透壓的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSΔpotD2在高滲的環(huán)境中存活率低于親本株和突變回復(fù)株,差異明顯。此外研究菌株的耐氧化和耐熱特性發(fā)現(xiàn),經(jīng)0.8mM的H202處理后,MSΔpotD2存活率不到10%,遠(yuǎn)低于親本株MS0721和CΔpotD2;MSΔpotD2熱激后的存活率也明顯低于MS0721和CΔpotD2,以上說明potD2基因缺失后影響了APP的環(huán)境壓力耐受能力。小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)測各菌株半數(shù)致死量LD50,結(jié)果表明MSΔpotD2缺失株毒力略低于親本株和互補(bǔ)株,但是差異不顯著,說明potD2基因缺失對APP毒力的影響很小。
【關(guān)鍵詞】：胸膜肺炎放線桿菌 多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 基因敲除 生物特性 壓力耐受
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略語表7-11
• 綜述11-21
• 1 豬傳染性胸膜肺炎概述11-12
• 2 胸膜肺炎放線桿菌致病機(jī)理12-14
• 3 細(xì)菌多胺及其代謝14-15
• 3.1 多胺合成14-15
• 3.2 多胺分解15
• 4 多胺與細(xì)菌致病性研究15-17
• 4.1 參與毒力蛋白的表達(dá)16
• 4.2 增強(qiáng)細(xì)菌逃避機(jī)體免疫16
• 4.3 影響細(xì)菌抗氧化脅迫和酸化脅迫16-17
• 4.4 影響生物膜的形成17
• 5 多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PotD研究進(jìn)展17-21
• 5.1 多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)18
• 5.2 多胺(亞精胺)結(jié)合蛋白PotD的研究18-20
• 5.2.1 大腸桿菌上研究進(jìn)展18-19
• 5.2.2 肺炎雙球菌中的研究進(jìn)展19
• 5.2.3 藍(lán)細(xì)菌中的研究進(jìn)展19-20
• 5.2.4 其他細(xì)菌中的研究進(jìn)展20
• 5.3 胸膜肺炎放線桿菌研究進(jìn)展20-21
• 研究目的意義21-22
• 第一章 APP potD2基因缺失株及其互補(bǔ)株構(gòu)建與鑒定22-49
• 1 材料22-24
• 1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒22
• 1.2 主要試劑22
• 1.3 培養(yǎng)基配置22-23
• 1.4 主要儀器23
• 1.5 引物設(shè)計(jì)23-24
• 2 方法24-37
• 2.1 胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA的提取24-25
• 2.2 potD2左右同源臂的擴(kuò)增及融合25-26
• 2.3 重組自殺性轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEMOC2-△potD2的構(gòu)建26-28
• 2.4 MS△potD2缺失株的構(gòu)建28-31
• 2.4.1 pEMOC2-△potD2質(zhì)粒的小量提取29
• 2.4.2 β2155大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化29-30
• 2.4.3 結(jié)合轉(zhuǎn)移30
• 2.4.4 正向篩選一次交換重組子及PCR鑒定30-31
• 2.4.5 負(fù)向篩選MS△potD2及PCR鑒定31
• 2.5 C△potD2互補(bǔ)株的構(gòu)建31-34
• 2.5.1 potD2基因表達(dá)框架的擴(kuò)增31-32
• 2.5.2 pLS88-potD2互補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建32-33
• 2.5.3 APP MS△potD2電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備33
• 2.5.4 互補(bǔ)質(zhì)粒pLS88-potD2的電轉(zhuǎn)化33-34
• 2.5.5 互補(bǔ)株C△potD2的PCR鑒定34
• 2.6 potD2免疫印跡檢測34-37
• 2.6.1 原核表達(dá)載體pET32a-potD2的構(gòu)建34-35
• 2.6.2 PotD2蛋白的體外誘導(dǎo)表達(dá)35-36
• 2.6.3 重組蛋白的分離純化36
• 2.6.4 PotD2蛋白抗血清的制備36
• 2.6.5 突變株免疫印跡鑒定分析36-37
• 3 結(jié)果37-45
• 3.1 potD2基因左右同源臂的擴(kuò)增及融合37-38
• 3.2 重組自殺性質(zhì)粒的PCR、酶切及測序鑒定38
• 3.3 缺失株的篩選與鑒定38-40
• 3.3.1 正向篩選鑒定38-39
• 3.3.2 負(fù)向篩選鑒定39-40
• 3.4 互補(bǔ)穿梭質(zhì)粒的鑒定分析40-41
• 3.5 互補(bǔ)株篩選鑒定41-42
• 3.6 western blot鑒定42-45
• 3.6.1 重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定42-43
• 3.6.2 重組蛋白PotD2的可溶性表達(dá)與純化結(jié)果43-45
• 3.6.3 缺失株及互補(bǔ)株免疫印跡鑒定結(jié)果45
• 4 討論45-48
• 4.1 關(guān)于缺失株的構(gòu)建45-47
• 4.2 關(guān)于互補(bǔ)株的構(gòu)建47-48
• 5. 小結(jié)48-49
• 第二章 MS△potD2缺失株及其互補(bǔ)株的生物學(xué)特性研究49-63
• 1 材料49
• 1.1 菌株49
• 1.2 主要試劑49
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材49
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物49
• 2 方法49-52
• 2.1 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)49-50
• 2.2 生長實(shí)驗(yàn)50
• 2.3 溶血性實(shí)驗(yàn)50
• 2.4 影響生物膜生成實(shí)50-51
• 2.5 壓力耐受性實(shí)驗(yàn)51
• 2.6 小鼠致病性實(shí)驗(yàn)51-52
• 2.6.1 活菌平板計(jì)數(shù)51
• 2.6.2 LD_(100)和LD_0測定51-52
• 2.6.3 半數(shù)致死量的測定52
• 3 結(jié)果52-59
• 3.1 遺傳穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)52-54
• 3.2 生長曲線的測定54
• 3.3 溶血活性結(jié)果54-55
• 3.4 生物膜實(shí)驗(yàn)55-56
• 3.5 壓力耐受56-58
• 3.5.1 高滲透壓耐受56
• 3.5.2 熱激實(shí)驗(yàn)56-57
• 3.5.3 氧化耐受57-58
• 3.6 LD_(50)的測定58-59
• 4 討論59-62
• 4.1 關(guān)于生長特性59
• 4.2 關(guān)于生物膜的形成59-60
• 4.3 關(guān)于抗環(huán)境壓力脅迫60-62
• 5 小結(jié)62-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 致謝71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號(hào)：746100