本文關(guān)鍵詞：荔枝組織特異表達(dá)基因分析及葉片特異啟動(dòng)子的分離與鑒定

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【摘要】：轉(zhuǎn)基因育種具有可定向改良性狀,育種周期短等優(yōu)勢(shì),是荔枝遺傳改良的重要潛在育種手段。適宜的植物表達(dá)載體是轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的關(guān)鍵,啟動(dòng)子是構(gòu)建載體的核心元件。包含組織特異型啟動(dòng)子的載體可介導(dǎo)外源基因在特定組織表達(dá),具有更多應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)比較荔枝葉、根、果皮、果肉以及果核等不同組織的轉(zhuǎn)錄組差異,篩選獲得組織特異性表達(dá)基因。以獲得的其中兩個(gè)葉片特異表達(dá)基因?yàn)閷?duì)象,分別克隆獲得了其啟動(dòng)子,構(gòu)建連有荔枝類(lèi)甜蛋白(LcTLP)基因的植物表達(dá)載體,通過(guò)基因槍進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證,并用花粉管通道法轉(zhuǎn)入了荔枝基因組中。本研究的主要結(jié)果如下：1、對(duì)荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析,獲得了荔枝5個(gè)組織共2072個(gè)組織特異表達(dá)基因,分別是：1123個(gè)葉片特異表達(dá)基因,556個(gè)根特異表達(dá)基因,98個(gè)果皮特異表達(dá)基因,128個(gè)果肉特異表達(dá)基因,167個(gè)果核特異表達(dá)基因。對(duì)部分基因表達(dá)的定量PCR分析發(fā)現(xiàn),這些基因的表達(dá)特征與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。2、應(yīng)用PCR法克隆了兩個(gè)葉片特異表達(dá)基因LcFKBP16-2和LcGRX的啟動(dòng)子。對(duì)這兩個(gè)啟動(dòng)子的堿基序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)啟動(dòng)子有很多相似性,如兩個(gè)啟動(dòng)子均含有大量CAAT-box、TATA-box及與光應(yīng)答作用相關(guān)的元件等。兩個(gè)啟動(dòng)子序列均包含很多其它順式調(diào)控元件。3、分別將LcFKBP16-2、LcGRX基因啟動(dòng)子與LcTLP基因、去CAMV 35S啟動(dòng)子的pCAMBIA1304質(zhì)粒按一定順序連接,構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-FKBP16-2-TLP、pCAMBIA1304-GRX-TLP。通過(guò)基因槍轟擊法檢測(cè)這兩個(gè)表達(dá)載體在各組織中表達(dá)的特性,結(jié)果表明,這兩個(gè)啟動(dòng)子均不能調(diào)控GUS基因在果肉中表達(dá),但能調(diào)控GUS基因在其它組織如葉片、根、果皮以及果核中表達(dá),表現(xiàn)出組織表達(dá)特異性。4、將構(gòu)建的兩個(gè)植物表達(dá)載體通過(guò)花粉管法轉(zhuǎn)化紫娘喜和白糖罌荔枝,獲得一批實(shí)生苗,從中鑒定出5株含pCAMBIAl304-FKBP16-2-TLP的白糖罌陽(yáng)性植株。
【關(guān)鍵詞】：荔枝(Litchi chinensis Sonn.) 組織特異表達(dá)基因 啟動(dòng)子 基因槍瞬時(shí)表達(dá) 花粉管通道
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S667.1
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 引言10-19
• 1.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展10-12
• 1.1.1 轉(zhuǎn)錄組及RNA-seq概述10
• 1.1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展10-12
• 1.1.3 荔枝轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展12
• 1.2 啟動(dòng)子分類(lèi)及研究進(jìn)展12-15
• 1.2.1 組成型啟動(dòng)子12-13
• 1.2.2 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子13
• 1.2.3 組織特異性啟動(dòng)子13-15
• 1.3 荔枝基因及啟動(dòng)子研究進(jìn)展15-16
• 1.3.1 荔枝基因研究進(jìn)展15
• 1.3.2 荔枝基因啟動(dòng)子研究進(jìn)展15-16
• 1.4 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化方法的研究進(jìn)展16-17
• 1.4.1 基因槍法16
• 1.4.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法16-17
• 1.4.3 花粉管通道法17
• 1.5 研究目的及意義17-18
• 1.6 研究?jī)?nèi)容18-19
• 2 材料與基本實(shí)驗(yàn)操作19-21
• 2.1 材料、試劑與儀器19-21
• 2.1.1 植物材料19
• 2.1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得及分析19
• 2.1.3 克隆載體和實(shí)驗(yàn)菌株19
• 2.1.4 酶和試劑19-20
• 2.1.5 引物合成及測(cè)序20
• 2.1.6 實(shí)驗(yàn)儀器20
• 2.1.7 試劑配制20-21
• 3 方法21-35
• 3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析21
• 3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證21-27
• 3.2.1 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)22
• 3.2.2 荔枝RNA提取22-23
• 3.2.3 cDNA第一鏈的合成23-24
• 3.2.4 PCR克隆組織特異表達(dá)基因24
• 3.2.5 PCR產(chǎn)物回收24-25
• 3.2.6 回收產(chǎn)物連接和轉(zhuǎn)化25
• 3.2.7 提取質(zhì)粒25-26
• 3.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法26
• 3.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)反應(yīng)26-27
• 3.3 啟動(dòng)子克隆與植物表達(dá)載體的構(gòu)建27-30
• 3.3.1 提取荔枝基因組DNA(改良CTAB法)27
• 3.3.2 啟動(dòng)子及LcTLP基因克隆27-28
• 3.3.3 表達(dá)載體的構(gòu)建28-30
• 3.3.4 連接目的片段30
• 3.3.5 酶切驗(yàn)證30
• 3.4 基因槍瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證30-32
• 3.4.1 質(zhì)粒提取30-31
• 3.4.2 微彈制備31
• 3.4.3 基因槍轟擊材料31
• 3.4.4 GUS組織化學(xué)染色31-32
• 3.5 表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)花粉管侵入法轉(zhuǎn)化荔枝32-35
• 3.5.1 制備農(nóng)桿菌感受態(tài)32
• 3.5.2 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌32
• 3.5.3 花粉管導(dǎo)入法32-33
• 3.5.4 實(shí)驗(yàn)操作33
• 3.5.5 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)33-35
• 4 結(jié)果與分析35-61
• 4.1 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果35-46
• 4.1.1 表達(dá)分析35-36
• 4.1.2 GO分析和KEGG分析結(jié)果36-46
• 4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果46-50
• 4.2.1 荔枝各組織RNA的提取以及反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)46-47
• 4.2.2 RT-PCR引物的溶解曲線分析47-48
• 4.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制48-49
• 4.2.4 九個(gè)基因在荔枝不同組織中的表達(dá)49-50
• 4.3 荔枝LcFKBP16-2與LcGRX基因的生物信息學(xué)分析50-51
• 4.4 啟動(dòng)子及LcTLP基因克隆51
• 4.5 啟動(dòng)子序列調(diào)控元件分析51-56
• 4.6 植物表達(dá)載體的構(gòu)建56
• 4.7 基因槍瞬時(shí)檢測(cè)56-57
• 4.8 花粉管導(dǎo)入法陽(yáng)性植株檢測(cè)57-61
• 5 討論61-63
• 5.1 關(guān)于組織特異表達(dá)基因功能和代謝通路分析61
• 5.2 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)元件與功能的關(guān)系61
• 5.3 荔枝轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化方法的研究61-63
• 6 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 縮略語(yǔ)表69-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：745933