本文關鍵詞：一種文蛤多肽基因的克隆、原核表達、純化及功能性研究

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【摘要】：本研究結合分子生物學、微生物學及發(fā)酵工程技術與理論,構建文蛤原肌球蛋白原核表達工程菌及使用親和層析的方法得到了目的蛋白。方法:根據(jù)基因工程技術結合原肌球蛋白相關基因信息,由其基因的特點設計出兩段PCR引物,擴增基因得到目的基因,測序分析克隆結果。使用T載體快速擴增克隆目的基因,連接目的基因與表達載體。然后通過大腸桿菌誘導表達得到目的產物,使用親和層析技術純化目的蛋白。結果:文蛤原肌球蛋白多肽(MMTM)是一種抗癌多肽,分子大小約為32 kDa。從蛋白特性分析結果中,蛋白理論上p I值為4.5�；驕y序結果與基因文庫中文蛤原肌球蛋白序列有十幾個堿基差異,而翻譯為蛋白后目的蛋白的結果和目的基因一致,這種差異的原因可能是原核表達載體大腸桿菌的密碼子偏好性和真核生物不同。最終由IPTG誘導發(fā)酵表達目的蛋白,凝膠分析可以看到在32 kDa左右有一深色條帶,使用蛋白測序分析這種蛋白即為目的產物。發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)目的產物的產量沒有達到預計要求,為了后續(xù)的藥理學實驗研究所以設計了優(yōu)化培養(yǎng)以提高目的蛋白的產量。方法:單因素實驗確定幾個因素最適條件,并篩選培養(yǎng)基的主要因素,選用五種培養(yǎng)基LB、LB+M9、M9、SOB、2*TY的搖瓶發(fā)酵,再根據(jù)結果設計培養(yǎng)基優(yōu)化實驗。首先使用PB設計確定發(fā)酵的主要因素及水平,然后由PB實驗篩選因素中的最大影響因素設計交互實驗結果得到各個因素最佳組合水平。結果:驗證了適合發(fā)酵培養(yǎng)的因素有:有機碳源如葡萄糖、酵母粉及胰蛋白胨等,氮源如氯化銨、酵母粉及胰蛋白胨,無機鹽成分等。這些因素都會影響發(fā)酵的進行,但環(huán)境因素如pH及溶氧量等因素也是制約的因素,而由于條件的限制實驗未能進行。從五種培養(yǎng)基的篩選得出LB+M9混合培養(yǎng)基是大腸桿菌培養(yǎng)的合適選擇,搖瓶發(fā)酵中菌體量達到50 g/L,說明充足的營養(yǎng)可以提高生物利用。PB設計結果說明葡萄糖、酵母粉及硫酸鎂是影響目的蛋白產量的主要因素,然后利用中心點實驗設計驗證這三種因素的相互作用及結果,結果顯示整模型統(tǒng)計學有效,設計符合發(fā)酵實驗要求,其中葡萄糖和酵母粉對實驗結果具有交互影響,通過實驗優(yōu)化驗證目的產物得率提高了56%。通過體外抑制實驗驗證了目的產物對癌細胞抑制作用。利用MTT方法評價目的蛋白的細胞活性,DAPI染色方法說明了目的蛋白對癌細胞核形態(tài)及變化的作用,從而評價藥物的作用。方法:研究通過體外細胞培養(yǎng)技術及MTT細胞抑制率實驗評價了MMTM蛋白的癌細胞抑制活性。使用DAPI染色觀察到MMTM細胞形態(tài)有顯著變化。結果:細胞抑制實驗表明MMTM對細胞有很好的抑制作用,在高濃度情況下可以很好的誘導細胞的凋亡,細胞形態(tài)表現(xiàn)為細胞固縮破碎,細胞質釋放細胞死亡。DAPI染色結果表明加MMTM后細胞染色質顏色較亮,細胞核明顯固縮,表現(xiàn)出不同程度的核碎片。由低到高目的蛋白濃度對細胞呈現(xiàn)為一定的濃度梯度,對肺及胰腺癌都呈現(xiàn)一定的濃度梯度活性,說明蛋白具有很好的的抗癌活性。
【關鍵詞】：多肽 原核表達 發(fā)酵優(yōu)化 細胞毒活性
【學位授予單位】：青島科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q51
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 文獻綜述10-22
• 1.關于文蛤研究10-12
• 1.1 文蛤的活性成分10-11
• 1.2 文蛤的藥理作用11-12
• 2 抗癌藥物研究12-21
• 2.1 中草藥抗癌研究14-18
• 2.2 化學藥物抗癌研究18-20
• 2.3 納米材料的抗癌研究20-21
• 小節(jié)21-22
• 第二章 原核表達體系構建及鑒定22-48
• 1.試劑與材料22-25
• 1.1 材料22-23
• 1.2 實驗試劑23-24
• 1.3 實驗儀器24-25
• 2 試劑配制25-26
• 2.1 水平電泳試劑配制25
• 2.2 SDS-page電泳試劑配制25-26
• 2.3 透析液緩沖液配制26
• 3．實驗方法26-38
• 3.1 文蛤總RNA提取26-27
• 3.2 DNA合成27-31
• 3.3 原核表達構建31-35
• 3.4 蛋白表達純化35-37
• 3.5 目的蛋白含量測定37-38
• 4 實驗結果38-45
• 4.1 文蛤總RNA質量38
• 4.2 PCR反應結果38-39
• 4.3 目的基因的序列測定及分析39-42
• 4.4 蛋白表達純化結果42-45
• 5 討論45-46
• 小節(jié)46-48
• 第三章 響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基48-67
• 1. 材料與儀器48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 實驗試劑48-49
• 1.3 實驗儀器49-50
• 2 試劑配制50-52
• 2.1 單因素培養(yǎng)基設定50
• 2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基50-52
• 2.3 免疫熒光檢測試劑52
• 3 試驗方法52-56
• 3.1 單因素實驗53
• 3.2 五種培養(yǎng)基的發(fā)酵53
• 3.3 PB實驗設計53-54
• 3.4 響應面設計54-55
• 3.5 目的蛋白含量測定55-56
• 4. 實驗結果56-65
• 4.1 單因素實驗結果56-58
• 4.2 五種不同發(fā)酵培養(yǎng)基58-59
• 4.3 PB實驗結果與分析59-60
• 4.4 響應面實驗結果60-64
• 4.5 免疫印跡實驗結果64-65
• 5 討論65-66
• 小節(jié)66-67
• 第四章 蛋白的功能性研究67-77
• 1．試劑與材料67-68
• 1.1 實驗材料67
• 1.2 實驗設備67-68
• 2.試劑配制68-69
• 3.試驗方法69-72
• 3.1 細胞復蘇69
• 3.2 細胞傳代69-70
• 3.3 細胞保存70
• 3.4 細胞質抑制率實驗70-71
• 3.5 DAPI染色71-72
• 4.實驗結果72-75
• 4.1 抑制率測定72-73
• 4.2 DAPI染色結果73-75
• 5．討論75-76
• 小節(jié)76-77
• 結論77-78
• 參考文獻78-84
• 致謝84-85
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文85-86

【參考文獻】

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本文編號：740827