本文關(guān)鍵詞：一種文蛤多肽基因的克隆、原核表達(dá)、純化及功能性研究

  更多相關(guān)文章： 多肽 原核表達(dá) 發(fā)酵優(yōu)化 細(xì)胞毒活性

【摘要】：本研究結(jié)合分子生物學(xué)、微生物學(xué)及發(fā)酵工程技術(shù)與理論,構(gòu)建文蛤原肌球蛋白原核表達(dá)工程菌及使用親和層析的方法得到了目的蛋白。方法:根據(jù)基因工程技術(shù)結(jié)合原肌球蛋白相關(guān)基因信息,由其基因的特點(diǎn)設(shè)計(jì)出兩段PCR引物,擴(kuò)增基因得到目的基因,測(cè)序分析克隆結(jié)果。使用T載體快速擴(kuò)增克隆目的基因,連接目的基因與表達(dá)載體。然后通過(guò)大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)得到目的產(chǎn)物,使用親和層析技術(shù)純化目的蛋白。結(jié)果:文蛤原肌球蛋白多肽(MMTM)是一種抗癌多肽,分子大小約為32 kDa。從蛋白特性分析結(jié)果中,蛋白理論上p I值為4.5�；驕y(cè)序結(jié)果與基因文庫(kù)中文蛤原肌球蛋白序列有十幾個(gè)堿基差異,而翻譯為蛋白后目的蛋白的結(jié)果和目的基因一致,這種差異的原因可能是原核表達(dá)載體大腸桿菌的密碼子偏好性和真核生物不同。最終由IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)目的蛋白,凝膠分析可以看到在32 kDa左右有一深色條帶,使用蛋白測(cè)序分析這種蛋白即為目的產(chǎn)物。發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)物的產(chǎn)量沒(méi)有達(dá)到預(yù)計(jì)要求,為了后續(xù)的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究所以設(shè)計(jì)了優(yōu)化培養(yǎng)以提高目的蛋白的產(chǎn)量。方法:單因素實(shí)驗(yàn)確定幾個(gè)因素最適條件,并篩選培養(yǎng)基的主要因素,選用五種培養(yǎng)基LB、LB+M9、M9、SOB、2*TY的搖瓶發(fā)酵,再根據(jù)結(jié)果設(shè)計(jì)培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。首先使用PB設(shè)計(jì)確定發(fā)酵的主要因素及水平,然后由PB實(shí)驗(yàn)篩選因素中的最大影響因素設(shè)計(jì)交互實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到各個(gè)因素最佳組合水平。結(jié)果:驗(yàn)證了適合發(fā)酵培養(yǎng)的因素有:有機(jī)碳源如葡萄糖、酵母粉及胰蛋白胨等,氮源如氯化銨、酵母粉及胰蛋白胨,無(wú)機(jī)鹽成分等。這些因素都會(huì)影響發(fā)酵的進(jìn)行,但環(huán)境因素如pH及溶氧量等因素也是制約的因素,而由于條件的限制實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)行。從五種培養(yǎng)基的篩選得出LB+M9混合培養(yǎng)基是大腸桿菌培養(yǎng)的合適選擇,搖瓶發(fā)酵中菌體量達(dá)到50 g/L,說(shuō)明充足的營(yíng)養(yǎng)可以提高生物利用。PB設(shè)計(jì)結(jié)果說(shuō)明葡萄糖、酵母粉及硫酸鎂是影響目的蛋白產(chǎn)量的主要因素,然后利用中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)驗(yàn)證這三種因素的相互作用及結(jié)果,結(jié)果顯示整模型統(tǒng)計(jì)學(xué)有效,設(shè)計(jì)符合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)要求,其中葡萄糖和酵母粉對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有交互影響,通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化驗(yàn)證目的產(chǎn)物得率提高了56%。通過(guò)體外抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了目的產(chǎn)物對(duì)癌細(xì)胞抑制作用。利用MTT方法評(píng)價(jià)目的蛋白的細(xì)胞活性,DAPI染色方法說(shuō)明了目的蛋白對(duì)癌細(xì)胞核形態(tài)及變化的作用,從而評(píng)價(jià)藥物的作用。方法:研究通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及MTT細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了MMTM蛋白的癌細(xì)胞抑制活性。使用DAPI染色觀察到MMTM細(xì)胞形態(tài)有顯著變化。結(jié)果:細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)表明MMTM對(duì)細(xì)胞有很好的抑制作用,在高濃度情況下可以很好的誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞固縮破碎,細(xì)胞質(zhì)釋放細(xì)胞死亡。DAPI染色結(jié)果表明加MMTM后細(xì)胞染色質(zhì)顏色較亮,細(xì)胞核明顯固縮,表現(xiàn)出不同程度的核碎片。由低到高目的蛋白濃度對(duì)細(xì)胞呈現(xiàn)為一定的濃度梯度,對(duì)肺及胰腺癌都呈現(xiàn)一定的濃度梯度活性,說(shuō)明蛋白具有很好的的抗癌活性。
【關(guān)鍵詞】：多肽 原核表達(dá) 發(fā)酵優(yōu)化 細(xì)胞毒活性
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;Q51
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-22
• 1.關(guān)于文蛤研究10-12
• 1.1 文蛤的活性成分10-11
• 1.2 文蛤的藥理作用11-12
• 2 抗癌藥物研究12-21
• 2.1 中草藥抗癌研究14-18
• 2.2 化學(xué)藥物抗癌研究18-20
• 2.3 納米材料的抗癌研究20-21
• 小節(jié)21-22
• 第二章 原核表達(dá)體系構(gòu)建及鑒定22-48
• 1.試劑與材料22-25
• 1.1 材料22-23
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑23-24
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 2 試劑配制25-26
• 2.1 水平電泳試劑配制25
• 2.2 SDS-page電泳試劑配制25-26
• 2.3 透析液緩沖液配制26
• 3．實(shí)驗(yàn)方法26-38
• 3.1 文蛤總RNA提取26-27
• 3.2 DNA合成27-31
• 3.3 原核表達(dá)構(gòu)建31-35
• 3.4 蛋白表達(dá)純化35-37
• 3.5 目的蛋白含量測(cè)定37-38
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-45
• 4.1 文蛤總RNA質(zhì)量38
• 4.2 PCR反應(yīng)結(jié)果38-39
• 4.3 目的基因的序列測(cè)定及分析39-42
• 4.4 蛋白表達(dá)純化結(jié)果42-45
• 5 討論45-46
• 小節(jié)46-48
• 第三章 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基48-67
• 1. 材料與儀器48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑48-49
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器49-50
• 2 試劑配制50-52
• 2.1 單因素培養(yǎng)基設(shè)定50
• 2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基50-52
• 2.3 免疫熒光檢測(cè)試劑52
• 3 試驗(yàn)方法52-56
• 3.1 單因素實(shí)驗(yàn)53
• 3.2 五種培養(yǎng)基的發(fā)酵53
• 3.3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)53-54
• 3.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)54-55
• 3.5 目的蛋白含量測(cè)定55-56
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-65
• 4.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-58
• 4.2 五種不同發(fā)酵培養(yǎng)基58-59
• 4.3 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析59-60
• 4.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-64
• 4.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-65
• 5 討論65-66
• 小節(jié)66-67
• 第四章 蛋白的功能性研究67-77
• 1．試劑與材料67-68
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料67
• 1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備67-68
• 2.試劑配制68-69
• 3.試驗(yàn)方法69-72
• 3.1 細(xì)胞復(fù)蘇69
• 3.2 細(xì)胞傳代69-70
• 3.3 細(xì)胞保存70
• 3.4 細(xì)胞質(zhì)抑制率實(shí)驗(yàn)70-71
• 3.5 DAPI染色71-72
• 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果72-75
• 4.1 抑制率測(cè)定72-73
• 4.2 DAPI染色結(jié)果73-75
• 5．討論75-76
• 小節(jié)76-77
• 結(jié)論77-78
• 參考文獻(xiàn)78-84
• 致謝84-85
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文85-86

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：740827