本文關(guān)鍵詞：基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的陽春砂揮發(fā)性萜類合酶基因的挖掘

  更多相關(guān)文章： 陽春砂 轉(zhuǎn)錄組 萜類合酶基因 基因克隆

【摘要】：1目的通過對陽春砂轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜數(shù)據(jù)深入研究,挖掘揮發(fā)性萜類合酶相關(guān)基因,并對其基因表達(dá)特性及功能進行研究,為深入認(rèn)識陽春砂揮發(fā)性萜類代謝途徑和分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ),為推進陽春砂萜類活性成分的代謝工程調(diào)控及種質(zhì)資源優(yōu)化提供幫助。2方法通過對陽春砂果實不同成熟時期及MeJA誘導(dǎo)實驗2個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中KEGG pathway注釋情況進行篩選并統(tǒng)計,并結(jié)合陽春砂中含有的主要揮發(fā)性萜類成分及其在單萜、倍半萜類化合物生物合成途徑中的相關(guān)酶基因,在NCBI中查找并下載龍腦基二磷酸合酶、蒎烯合酶、松油烯合酶等4個單萜合酶與雙環(huán)大根香葉烯合酶等5個倍半萜合酶的其他物種中相應(yīng)基因的蛋白序列,通過本地BLAST軟件對陽春砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行blastp、tblastn比對再注釋,獲取更多候選unigene,再通過同源進化分析、轉(zhuǎn)錄組間關(guān)聯(lián)比對等方法最終篩選出陽春砂揮發(fā)性萜類合酶候選基因(AvTPS)。對候選AvTPS基因進行開放閱讀框(ORF)預(yù)測,并對含有全長ORF的AvTPS基因設(shè)計引物,擴增其編碼區(qū)全長DNA,通過平末端連接的方法構(gòu)建目的AvTPS基因的克隆載體；并通過生物信息學(xué)分析,推測這些基因的開放閱讀框、編碼氨基酸、編碼蛋白分子質(zhì)量、等電點、親疏水性等理化性質(zhì),預(yù)測亞細(xì)胞定位及一二級結(jié)構(gòu),并通過與已知TPS的多序列比對及遺傳進化分析推測其功能。通過絕對定量法對克隆所得AvTPS基因進行實時熒光定量PCR檢測,分析其在陽春砂不同部位及不同成熟時期的表達(dá)水平變化；并通過MeJA誘導(dǎo)實驗中AvTPS基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)及揮發(fā)性萜類含量數(shù)據(jù)進行兩兩線性相關(guān)系數(shù)的計算,分析AvTPS基因與陽春砂揮發(fā)性萜類成分的相關(guān)性。3結(jié)果3.1陽春砂揮發(fā)性萜類合酶基因的挖掘本文從2個陽春砂轉(zhuǎn)錄組中共篩選獲得揮發(fā)性萜類合成下游途徑相關(guān)unigene 27個,包括轉(zhuǎn)錄組直接注釋unigene 9個,本地blast再注釋unigene18個；并結(jié)合與NCBIblastp所得相似序列的同源進化分析、轉(zhuǎn)錄組間unigene的序列相似性分析,最終選定11個陽春砂揮發(fā)性萜類合酶候選基因,重命名為AvTPS1～11。3.2 AvTPS編碼區(qū)全長序列的克隆及其編碼蛋白功能分析對有全長ORF的4個AvTPS編碼區(qū)全長進行了克隆,AvTPS1包含1803bp的ORF,編碼600個氨基酸；AvTPS3包含1791bp的ORF,編碼597個氨基酸；AvTPS5包含888bp的ORF,編碼295個氨基酸；AvTPS8包含1650bp的ORF,編碼549個氨基酸；并成功構(gòu)建其重組克隆載體pLB-AvTPS1、pLB-AvTPS3、pLB-AvTPS5和pLB-AvTPS8。除AvTPS5外,其他3個AvTPS預(yù)測蛋白分子量均在60-70kDa之間、等電點接近5.0、pH接近中性,與其他已知TPS相似；結(jié)構(gòu)上也具有DDXXD等TPS特征功能域,與其他已知TPS也表現(xiàn)出較近的遺傳距離,將AvTPS1和AvTPS3歸類于單萜合酶,AvTPS8歸類于倍半萜合酶。AvTPS5編碼蛋白各性質(zhì)則更接近于萜類環(huán)化下一階段的脫氫還原酶。3.3 AvTPS基因的表達(dá)變化及相關(guān)性分析本研究對克隆所得4個AvTPS基因進行了qRT-qPCR表達(dá)水平檢測,結(jié)果表明AvTPS1、AvTPS3和AvTPS8表現(xiàn)出顯著的組織特異性,AvTPS1、AvTPS3和AvTPS5則表現(xiàn)出了生長發(fā)育階段的表達(dá)特異性,符合萜類合酶表達(dá)與調(diào)控的時空差異的特點。進一步將各AvTPS的表達(dá)量數(shù)據(jù)與陽春砂揮發(fā)性萜類數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析,證明大部分AvTPS均與陽春砂中的揮發(fā)性萜類化合物含量總量呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性,AvTPS2、 AvTPS5、AvTPS7和AvTPS9表現(xiàn)出較一致的相關(guān)模式,AvTPS6和AvTPS11則往往表現(xiàn)出另一類相反的相關(guān)模式；且根據(jù)與具體萜類化合物含量的關(guān)聯(lián)分析,在果皮中表達(dá)較高的AvTPS1、AvTPS2等及在種子團中表達(dá)較高的AvTPS3、AvTPS6等分別與不同部位的主要成分分別呈正相關(guān),可能在這些物質(zhì)的合成途徑中起到一定作用。4結(jié)論結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、表達(dá)譜數(shù)據(jù)的深入挖掘和與揮發(fā)性萜類化合物數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián),有效篩選出了陽春砂11個值得后續(xù)研究的萜類合酶基因；其中對部分AvTPS的克隆更為進一步的基因功能鑒定和應(yīng)用于陽春砂揮發(fā)性萜類代謝工程的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：陽春砂 轉(zhuǎn)錄組 萜類合酶基因 基因克隆
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S567.239
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 引言11-21
• 1 研究背景11-19
• 1.1 陽春砂及揮發(fā)性萜類11-13
• 1.2 揮發(fā)性萜類生物合成途徑及其關(guān)鍵酶的研究進展13-17
• 1.3 揮發(fā)性萜類合酶基因的研究進展17-18
• 1.4 生物信息學(xué)在功能基因挖掘中的應(yīng)用18-19
• 2 本課題組的研究思路及前期研究進展19-20
• 3 本研究工作的總體思路、主要研究方法和預(yù)期結(jié)果20-21
• 3.1 陽春砂轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜數(shù)據(jù)整理及深入挖掘20
• 3.2 目的基因編碼區(qū)全長的克隆及序列分析20
• 3.3 陽春砂單萜合酶基因表達(dá)模式分析20-21
• 第一章 陽春砂揮發(fā)性萜類合酶基因的轉(zhuǎn)錄組分析21-33
• 1 數(shù)據(jù)與方法21-22
• 1.1 轉(zhuǎn)錄組與表達(dá)譜數(shù)據(jù)21
• 1.2 轉(zhuǎn)錄組分析方法21-22
• 2 結(jié)果與分析22-30
• 2.1 已注釋萜類合酶基因的整理22-24
• 2.2 本地blast再注釋萜類合酶基因的整理24-27
• 2.3 AvTPS的同源進化分析27-30
• 2.4 轉(zhuǎn)錄組間序列比對分析30
• 3 討論30-32
• 4 小結(jié)32-33
• 第二章 AvTPS編碼區(qū)全長序列的克隆及其編碼蛋白功能分析33-54
• 1 材料、主要試劑與儀器33-34
• 1.1 植物材料33
• 1.2 菌株33
• 1.3 載體33
• 1.4 主要試劑33-34
• 1.5 主要儀器設(shè)備34
• 2 方法34-37
• 2.1 AvTPS編碼區(qū)全長序列的克隆34-37
• 2.2 AvTPS編碼蛋白的生物信息學(xué)分析37
• 3 結(jié)果與分析37-53
• 3.1 AvTPS全長編碼區(qū)序列的克隆37-44
• 3.2 AvTPS編碼蛋白性質(zhì)預(yù)測44-47
• 3.3 AvTPS編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析及多序列對比47-52
• 3.4 AvTPS編碼蛋白遺傳進化分析52-53
• 4 討論53
• 5 小結(jié)53-54
• 第三章 AvTPS基因的表達(dá)變化及相關(guān)性分析54-65
• 1 材料、主要試劑與儀器54
• 1.1 植物材料54
• 1.2 實驗前期數(shù)據(jù)54
• 1.3 主要試劑54
• 1.4 主要儀器設(shè)備54
• 2 方法54-56
• 2.1 部分AvTPS表達(dá)水平檢測54-55
• 2.2 相關(guān)性分析及圖表繪制55-56
• 3 結(jié)果與分析56-62
• 3.1 部分AvTPS熒光定量表達(dá)水平檢測56-59
• 3.2 AvTPS表達(dá)水平與揮發(fā)性萜類總量相關(guān)分析59-62
• 3.3 AvTPS表達(dá)水平與各揮發(fā)性萜類的相關(guān)性分析62
• 4 討論62-64
• 5 小結(jié)64-65
• 第四章 結(jié)論與展望65-67
• 1 結(jié)論65-66
• 1.1 陽春砂揮發(fā)性萜類合酶相關(guān)基因AvTPS的挖掘65
• 1.2 AvTPS編碼區(qū)全長序列的克隆及其編碼蛋白功能分析65
• 1.3 AvTPS基因的表達(dá)水平變化及相關(guān)性分析65-66
• 2 展望66-67
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 附錄70-76
• 發(fā)表論文與參與課題情況76-77
• 致謝77-79
• 統(tǒng)計學(xué)審核證明79

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