本文關(guān)鍵詞：小麥泛素基因Ta-Ub2改善短柄草非生物脅迫耐性研究

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【摘要】：泛素是一種高度保守的小分子球狀蛋白,廣泛存在于真核生物中。泛素26S蛋白酶體途徑與植物的非生物脅迫響應(yīng)密切相關(guān),而泛素作為泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)中的一員起著極其重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,小麥泛素基因Ta-Ub2在雙子葉植物煙草的逆境脅迫過(guò)程中起重要作用,且該基因的表達(dá)加快了煙草的發(fā)育進(jìn)程。本研究在克隆了小麥泛素基因Ta-Ub2的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了Ta-Ub2基因的組成型和脅迫誘導(dǎo)型表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化單子葉模式植物短柄草,獲得了過(guò)量表達(dá)和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)泛素的轉(zhuǎn)基因短柄草株系多個(gè)。利用轉(zhuǎn)基因株系,研究了Ta-Ub2在單子葉植物短柄草生長(zhǎng)發(fā)育及逆境耐性中的作用,分析了Ta-Ub2提高轉(zhuǎn)基因短柄草非生物脅迫耐性的生理生化及分子機(jī)制。其主要結(jié)果和結(jié)論如下:(1)QRT-PCR分析結(jié)果表明,Ta-Ub2在小麥的根、莖、葉中均有表達(dá),并且葉中的表達(dá)量最高,而根莖中的表達(dá)量最少。Ta-Ub2的表達(dá)受PEG、Na Cl和4?C冷脅迫的誘導(dǎo)上調(diào)。(2)通過(guò)基因組PCR及q RT-PCR檢測(cè)鑒定,獲得了不同表達(dá)水平的組成型和脅迫誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)小麥泛素基因Ta-Ub2的轉(zhuǎn)基因短柄草植株。泛素蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果表明,正常條件下,轉(zhuǎn)基因和野生型株系中泛素蛋白豐度沒(méi)有明顯差異,但干旱處理后,轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)多聚泛素蛋白豐度高于野生型,而泛素單體蛋白仍無(wú)明顯差異。(3)在正常生長(zhǎng)條件下,組成型過(guò)表達(dá)小麥泛素基因Ta-Ub2的轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比生長(zhǎng)遲緩,前期株高較低,后期趨于相同,且千粒重下降。而誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因植株與野生型無(wú)明顯差異。(4)組成型過(guò)量與誘導(dǎo)表達(dá)Ta-Ub2不僅提高轉(zhuǎn)基因短柄草的干旱脅迫耐性,也提高了其鹽脅迫和低溫脅迫耐性。與野生型相比,干旱脅迫下,轉(zhuǎn)基因短柄草具有較高的存活率、較高的相對(duì)含水量、較低的水分散失速率以及較高的生物量。同時(shí),轉(zhuǎn)基因短柄草的可溶性糖和脯氨酸含量較高,滲透勢(shì)較低。這說(shuō)明Ta-Ub2的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累,降低滲透勢(shì),進(jìn)而在一定程度上緩解由干旱脅迫造成的水分流失,促進(jìn)植物體內(nèi)的水分保持,提高植物的干旱耐性。(5)干旱脅迫下,轉(zhuǎn)基因短柄草中H2O2含量以及O2·-產(chǎn)生速率均低于野生型,并且轉(zhuǎn)基因短柄草中蛋白羰基化水平以及MDA含量也低于野生型。同時(shí),轉(zhuǎn)基因植株抗氧化酶活性水平總體較高。這些結(jié)果表明,Ta-Ub2的過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株的活性氧清除能力,降低了氧化脅迫對(duì)細(xì)胞造成的傷害。(6)檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因植株中某些抗性相關(guān)基因的表達(dá),包括抗氧化相關(guān)基因和脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分被檢測(cè)基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平較野生型高。綜上所述,在單子葉模式植物短柄草中過(guò)表達(dá)與誘導(dǎo)表達(dá)Ta-Ub2基因改變了轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育表型,且與雙子葉模式植物煙草中的表型不一致。過(guò)量表達(dá)與誘導(dǎo)表達(dá)該基因均提高了轉(zhuǎn)基因短柄草的脅迫耐性,這與轉(zhuǎn)基因煙草的結(jié)果一致。在生理生化水平上,轉(zhuǎn)基因短柄草抗逆性的提高與細(xì)胞水分狀況的維持以及抗氧化能力的提高有關(guān)。在分子水平上,Ta-Ub2參與了轉(zhuǎn)基因植株中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：泛素 小麥 短柄草 非生物脅迫 抗氧化能力
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-24
• 1.1 泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)13
• 1.2 泛素13-16
• 1.2.1 泛素的結(jié)構(gòu)14-15
• 1.2.2 泛素的分布15
• 1.2.3 泛素的種類(lèi)15-16
• 1.3 泛素啟動(dòng)酶系統(tǒng)16-18
• 1.3.1 泛素活化酶（E1）16-17
• 1.3.2 泛素結(jié)合酶（E2）17
• 1.3.3 泛素連接酶（E3）17-18
• 1.4 26S蛋白酶體18-19
• 1.5 泛素/26S蛋白酶體途徑的功能19-21
• 1.5.1 泛素/26S蛋白酶體途徑與植物激素信號(hào)途徑19-20
• 1.5.2 泛素/26S蛋白酶體途徑參與細(xì)胞周期調(diào)控20
• 1.5.3 泛素/26S蛋白酶體途徑參與生物的脅迫適應(yīng)過(guò)程20-21
• 1.6 植物啟動(dòng)子的研究進(jìn)展21-23
• 1.6.1 組成型啟動(dòng)子21-22
• 1.6.2 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子22
• 1.6.3 組織特異性啟動(dòng)子22-23
• 1.7 本研究的目的及意義23-24
• 2 材料與方法24-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-26
• 2.1.1 植物材料24
• 2.1.2 小麥與短柄草的培養(yǎng)及處理24
• 2.1.2.1 用于遺傳轉(zhuǎn)化的短柄草實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)24
• 2.1.2.2 用于基因克隆與基因表達(dá)分析的小麥實(shí)驗(yàn)材料的處理24
• 2.1.2.3 實(shí)驗(yàn)材料的處理24
• 2.1.3 菌株與轉(zhuǎn)化質(zhì)粒24
• 2.1.4 酶與生化試劑24-25
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)引物25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-40
• 2.2.1 CTAB法提取短柄草基因組DNA26
• 2.2.2 Trizol法提取RNA26-27
• 2.2.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈的合成27
• 2.2.4 Ta-Ub2基因的克隆27-28
• 2.2.5 瓊脂糖凝膠回收28
• 2.2.6 鏈接反應(yīng)28
• 2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化28-29
• 2.2.8 菌落篩選29
• 2.2.9 DNA序列測(cè)定29
• 2.2.10 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取29-30
• 2.2.11 表達(dá)載體的構(gòu)建30
• 2.2.12 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化30-31
• 2.2.13 短柄草轉(zhuǎn)化31-33
• 2.2.13.1 愈傷組織誘導(dǎo)31
• 2.2.13.2 農(nóng)桿菌侵染愈傷組織31
• 2.2.13.3 轉(zhuǎn)基因植株的篩選與再生31-32
• 2.2.13.4 轉(zhuǎn)基因短柄草的PCR鑒定32
• 2.2.13.5 熒光定量PCR32-33
• 2.2.14 蛋白雜交檢測(cè)33-36
• 2.2.14.1 植物總蛋白的提取33
• 2.2.14.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）33-34
• 2.2.14.3 半干法蛋白轉(zhuǎn)移34-35
• 2.2.14.4 封閉及雜交35-36
• 2.2.15 生理指標(biāo)測(cè)定36-39
• 2.2.15.1 失水速率的測(cè)定36
• 2.2.15.2 葉片相對(duì)含水量的測(cè)定36
• 2.2.15.3 葉綠素含量的測(cè)定36
• 2.2.15.4 土壤含水量的測(cè)定36-37
• 2.2.15.5 葉片滲透勢(shì)的測(cè)定37
• 2.2.15.6 脯氨酸含量的測(cè)定37
• 2.2.15.7 可溶性糖的測(cè)定（蒽酮法）37-38
• 2.2.15.8 DAB和NBT染色38
• 2.2.15.9 過(guò)氧化氫含量的測(cè)定38
• 2.2.15.10 超氧陰離子自由基的測(cè)定38
• 2.2.15.11 丙二醛（MDA）的含量測(cè)定38-39
• 2.2.15.12 抗氧化酶活性的測(cè)定39
• 2.2.15.13 電導(dǎo)法測(cè)量植物電解質(zhì)外滲39
• 2.2.16 統(tǒng)計(jì)分析39-40
• 3 結(jié)果與分析40-55
• 3.1 Ta-Ub2序列系統(tǒng)進(jìn)化分析40
• 3.2 Ta-Ub2基因在小麥中的表達(dá)模式分析40-41
• 3.2.1 Ta-Ub2基因在小麥不同部位的表達(dá)40-41
• 3.2.2 Ta-Ub2基因?qū)Σ煌巧锩{迫處理的響應(yīng)模式41
• 3.3 轉(zhuǎn)基因短柄草的獲得41-44
• 3.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建41-42
• 3.3.2 短柄草的遺傳轉(zhuǎn)化42-43
• 3.3.3 轉(zhuǎn)基因短柄草的篩選鑒定43-44
• 3.4 轉(zhuǎn)基因短柄草植株的表型分析44-45
• 3.5 Ta-Ub2基因在短柄草逆境適應(yīng)中的功能分析45-48
• 3.5.1 轉(zhuǎn)Ta-Ub2基因短柄草在干旱脅迫下的生長(zhǎng)分析45-46
• 3.5.2 過(guò)表達(dá)與誘導(dǎo)表達(dá)小麥Ta-Ub2基因?qū)Χ瘫蓰}脅迫和低溫脅迫耐性的影響46-48
• 3.6 過(guò)表達(dá)與誘導(dǎo)表達(dá)小麥Ta-Ub2基因提高短柄草抗逆性的生理生化及分子機(jī)制分析48-50
• 3.6.1 干旱脅迫下Ta-Ub2的過(guò)表達(dá)提高了短柄草多聚泛素蛋白的積累48-49
• 3.6.2 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因短柄草滲透調(diào)節(jié)能力的影響49-50
• 3.7 過(guò)表達(dá)與誘導(dǎo)表達(dá)Ta-Ub2基因?qū)D(zhuǎn)基因短柄草抗氧化能力的影響50-55
• 3.7.1 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因短柄草過(guò)氧化氫含量和超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率的影響50-51
• 3.7.2 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因短柄草蛋白質(zhì)羰基化水平及MDA含量的影響51-52
• 3.7.3 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因短柄草抗氧化酶活性的影響52-53
• 3.7.4 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因短柄草抗氧化酶相關(guān)基因及CBF轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的影響53-55
• 4 討論55-59
• 5 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 致謝67-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況68

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