本文關鍵詞：小麥泛素基因Ta-Ub2改善短柄草非生物脅迫耐性研究

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【摘要】：泛素是一種高度保守的小分子球狀蛋白,廣泛存在于真核生物中。泛素26S蛋白酶體途徑與植物的非生物脅迫響應密切相關,而泛素作為泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)中的一員起著極其重要的作用。本實驗室前期研究表明,小麥泛素基因Ta-Ub2在雙子葉植物煙草的逆境脅迫過程中起重要作用,且該基因的表達加快了煙草的發(fā)育進程。本研究在克隆了小麥泛素基因Ta-Ub2的基礎上,構建了Ta-Ub2基因的組成型和脅迫誘導型表達載體,轉化單子葉模式植物短柄草,獲得了過量表達和脅迫誘導表達泛素的轉基因短柄草株系多個。利用轉基因株系,研究了Ta-Ub2在單子葉植物短柄草生長發(fā)育及逆境耐性中的作用,分析了Ta-Ub2提高轉基因短柄草非生物脅迫耐性的生理生化及分子機制。其主要結果和結論如下:(1)QRT-PCR分析結果表明,Ta-Ub2在小麥的根、莖、葉中均有表達,并且葉中的表達量最高,而根莖中的表達量最少。Ta-Ub2的表達受PEG、Na Cl和4?C冷脅迫的誘導上調。(2)通過基因組PCR及q RT-PCR檢測鑒定,獲得了不同表達水平的組成型和脅迫誘導型過表達小麥泛素基因Ta-Ub2的轉基因短柄草植株。泛素蛋白豐度檢測結果表明,正常條件下,轉基因和野生型株系中泛素蛋白豐度沒有明顯差異,但干旱處理后,轉基因植株體內多聚泛素蛋白豐度高于野生型,而泛素單體蛋白仍無明顯差異。(3)在正常生長條件下,組成型過表達小麥泛素基因Ta-Ub2的轉基因植株與野生型相比生長遲緩,前期株高較低,后期趨于相同,且千粒重下降。而誘導型轉基因植株與野生型無明顯差異。(4)組成型過量與誘導表達Ta-Ub2不僅提高轉基因短柄草的干旱脅迫耐性,也提高了其鹽脅迫和低溫脅迫耐性。與野生型相比,干旱脅迫下,轉基因短柄草具有較高的存活率、較高的相對含水量、較低的水分散失速率以及較高的生物量。同時,轉基因短柄草的可溶性糖和脯氨酸含量較高,滲透勢較低。這說明Ta-Ub2的過表達可以促進滲透調節(jié)物質的積累,降低滲透勢,進而在一定程度上緩解由干旱脅迫造成的水分流失,促進植物體內的水分保持,提高植物的干旱耐性。(5)干旱脅迫下,轉基因短柄草中H2O2含量以及O2·-產生速率均低于野生型,并且轉基因短柄草中蛋白羰基化水平以及MDA含量也低于野生型。同時,轉基因植株抗氧化酶活性水平總體較高。這些結果表明,Ta-Ub2的過表達提高了轉基因植株的活性氧清除能力,降低了氧化脅迫對細胞造成的傷害。(6)檢測了轉基因植株中某些抗性相關基因的表達,包括抗氧化相關基因和脅迫相關轉錄因子基因。結果發(fā)現(xiàn)大部分被檢測基因的表達量在轉基因植株中的表達水平較野生型高。綜上所述,在單子葉模式植物短柄草中過表達與誘導表達Ta-Ub2基因改變了轉基因植株的生長發(fā)育表型,且與雙子葉模式植物煙草中的表型不一致。過量表達與誘導表達該基因均提高了轉基因短柄草的脅迫耐性,這與轉基因煙草的結果一致。在生理生化水平上,轉基因短柄草抗逆性的提高與細胞水分狀況的維持以及抗氧化能力的提高有關。在分子水平上,Ta-Ub2參與了轉基因植株中脅迫相關基因的表達調控。
【關鍵詞】：泛素 小麥 短柄草 非生物脅迫 抗氧化能力
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-24
• 1.1 泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)13
• 1.2 泛素13-16
• 1.2.1 泛素的結構14-15
• 1.2.2 泛素的分布15
• 1.2.3 泛素的種類15-16
• 1.3 泛素啟動酶系統(tǒng)16-18
• 1.3.1 泛素活化酶（E1）16-17
• 1.3.2 泛素結合酶（E2）17
• 1.3.3 泛素連接酶（E3）17-18
• 1.4 26S蛋白酶體18-19
• 1.5 泛素/26S蛋白酶體途徑的功能19-21
• 1.5.1 泛素/26S蛋白酶體途徑與植物激素信號途徑19-20
• 1.5.2 泛素/26S蛋白酶體途徑參與細胞周期調控20
• 1.5.3 泛素/26S蛋白酶體途徑參與生物的脅迫適應過程20-21
• 1.6 植物啟動子的研究進展21-23
• 1.6.1 組成型啟動子21-22
• 1.6.2 誘導型啟動子22
• 1.6.3 組織特異性啟動子22-23
• 1.7 本研究的目的及意義23-24
• 2 材料與方法24-40
• 2.1 實驗材料24-26
• 2.1.1 植物材料24
• 2.1.2 小麥與短柄草的培養(yǎng)及處理24
• 2.1.2.1 用于遺傳轉化的短柄草實驗材料的培養(yǎng)24
• 2.1.2.2 用于基因克隆與基因表達分析的小麥實驗材料的處理24
• 2.1.2.3 實驗材料的處理24
• 2.1.3 菌株與轉化質粒24
• 2.1.4 酶與生化試劑24-25
• 2.1.5 實驗引物25-26
• 2.2 實驗方法26-40
• 2.2.1 CTAB法提取短柄草基因組DNA26
• 2.2.2 Trizol法提取RNA26-27
• 2.2.3 反轉錄cDNA第一條鏈的合成27
• 2.2.4 Ta-Ub2基因的克隆27-28
• 2.2.5 瓊脂糖凝膠回收28
• 2.2.6 鏈接反應28
• 2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉化28-29
• 2.2.8 菌落篩選29
• 2.2.9 DNA序列測定29
• 2.2.10 大腸桿菌質粒DNA的提取29-30
• 2.2.11 表達載體的構建30
• 2.2.12 農桿菌轉化30-31
• 2.2.13 短柄草轉化31-33
• 2.2.13.1 愈傷組織誘導31
• 2.2.13.2 農桿菌侵染愈傷組織31
• 2.2.13.3 轉基因植株的篩選與再生31-32
• 2.2.13.4 轉基因短柄草的PCR鑒定32
• 2.2.13.5 熒光定量PCR32-33
• 2.2.14 蛋白雜交檢測33-36
• 2.2.14.1 植物總蛋白的提取33
• 2.2.14.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）33-34
• 2.2.14.3 半干法蛋白轉移34-35
• 2.2.14.4 封閉及雜交35-36
• 2.2.15 生理指標測定36-39
• 2.2.15.1 失水速率的測定36
• 2.2.15.2 葉片相對含水量的測定36
• 2.2.15.3 葉綠素含量的測定36
• 2.2.15.4 土壤含水量的測定36-37
• 2.2.15.5 葉片滲透勢的測定37
• 2.2.15.6 脯氨酸含量的測定37
• 2.2.15.7 可溶性糖的測定（蒽酮法）37-38
• 2.2.15.8 DAB和NBT染色38
• 2.2.15.9 過氧化氫含量的測定38
• 2.2.15.10 超氧陰離子自由基的測定38
• 2.2.15.11 丙二醛（MDA）的含量測定38-39
• 2.2.15.12 抗氧化酶活性的測定39
• 2.2.15.13 電導法測量植物電解質外滲39
• 2.2.16 統(tǒng)計分析39-40
• 3 結果與分析40-55
• 3.1 Ta-Ub2序列系統(tǒng)進化分析40
• 3.2 Ta-Ub2基因在小麥中的表達模式分析40-41
• 3.2.1 Ta-Ub2基因在小麥不同部位的表達40-41
• 3.2.2 Ta-Ub2基因對不同非生物脅迫處理的響應模式41
• 3.3 轉基因短柄草的獲得41-44
• 3.3.1 表達載體的構建41-42
• 3.3.2 短柄草的遺傳轉化42-43
• 3.3.3 轉基因短柄草的篩選鑒定43-44
• 3.4 轉基因短柄草植株的表型分析44-45
• 3.5 Ta-Ub2基因在短柄草逆境適應中的功能分析45-48
• 3.5.1 轉Ta-Ub2基因短柄草在干旱脅迫下的生長分析45-46
• 3.5.2 過表達與誘導表達小麥Ta-Ub2基因對短柄草鹽脅迫和低溫脅迫耐性的影響46-48
• 3.6 過表達與誘導表達小麥Ta-Ub2基因提高短柄草抗逆性的生理生化及分子機制分析48-50
• 3.6.1 干旱脅迫下Ta-Ub2的過表達提高了短柄草多聚泛素蛋白的積累48-49
• 3.6.2 干旱脅迫對轉基因短柄草滲透調節(jié)能力的影響49-50
• 3.7 過表達與誘導表達Ta-Ub2基因對轉基因短柄草抗氧化能力的影響50-55
• 3.7.1 干旱脅迫對轉基因短柄草過氧化氫含量和超氧陰離子自由基產生速率的影響50-51
• 3.7.2 干旱脅迫對轉基因短柄草蛋白質羰基化水平及MDA含量的影響51-52
• 3.7.3 干旱脅迫對轉基因短柄草抗氧化酶活性的影響52-53
• 3.7.4 干旱脅迫對轉基因短柄草抗氧化酶相關基因及CBF轉錄因子基因表達的影響53-55
• 4 討論55-59
• 5 結論59-60
• 參考文獻60-67
• 致謝67-68
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況68

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本文編號：722515