本文關(guān)鍵詞：AAV9介導(dǎo)VEGF基因過表達(dá)對(duì)mdx小鼠的影響

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【摘要】：目的:Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophin,DMD)是一種X連鎖隱性遺傳致死性肌肉病,在存活男嬰中的發(fā)病率約為1/3500。以進(jìn)行性加重的對(duì)稱性肌肉無力和萎縮為主要臨床特征,患者一般6-12歲喪失行走能力,20歲左右死于心肺衰竭。DMD患者發(fā)病是由DMD基因突變導(dǎo)致dystrophin蛋白缺失引起。Dystrophin蛋白,一方面,作為細(xì)胞膜骨架維持肌細(xì)胞的完整性與穩(wěn)定性,對(duì)抗機(jī)械收縮對(duì)細(xì)胞造成的損傷;另一方面dystrophin蛋白有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用包括機(jī)械力的傳導(dǎo),以及聚集一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Dystrophin蛋白缺失導(dǎo)致肌纖維對(duì)機(jī)械和化學(xué)損傷更加敏感,同時(shí)引起肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路紊亂,進(jìn)而通過各種機(jī)制,如細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬凋亡等導(dǎo)致肌組織中大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肌纖維壞死,最終由脂肪和纖維結(jié)締組織代替。DMD的致病基因二十多年前就已經(jīng)被確定,但直到現(xiàn)在仍無有效的治療辦法。雖然基因治療為DMD患者提供了希望,但真正用于DMD的臨床治療并且達(dá)到治愈的目的還有很多難以克服的障礙。經(jīng)過多年的研究探索,我們對(duì)DMD的病理生理機(jī)制已經(jīng)有了很好的理解。因此,我們可以通過干預(yù)促進(jìn)肌營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞和分子機(jī)制,減慢DMD患者疾病進(jìn)展、改善臨床癥狀。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是生理性和病理性血管生成的主要調(diào)節(jié)因子,涉及調(diào)節(jié)血管生成,促肌細(xì)胞再生,改善灌注等多種生物學(xué)作用。已有研究證實(shí),在肌肉損傷性疾病模型中,VEGF可以減少肌肉損傷,促進(jìn)肌再生。近年來,以血管為靶點(diǎn)的治療,如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI),用于改善DMD患者心臟功能及系統(tǒng)性血管舒張能力,臨床試驗(yàn)已證明了其有效性。所以VEGF是否能減緩DMD患者的疾病進(jìn)展,改善臨床癥狀,值得我們進(jìn)一步探索。mdx小鼠是DMD研究的經(jīng)典動(dòng)物模型,由C57BL/10小鼠DMD基因自發(fā)點(diǎn)突變形成。本實(shí)驗(yàn)以AAV9為載體攜帶VEGF基因,經(jīng)尾靜脈注射入mdx小鼠體內(nèi),使mdx小鼠體內(nèi)VEGF過表達(dá),從而進(jìn)一步探討vegf能否改善mdx小鼠的肌肉組織病理及肌肉功能。方法:我們的前期實(shí)驗(yàn)觀察到mdx小鼠在8w時(shí)肌肉病理改變最為嚴(yán)重,在本實(shí)驗(yàn)中我們首先進(jìn)一步對(duì)8wmdx小鼠的肌肉損傷進(jìn)行了評(píng)估,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考及客觀可行的評(píng)估方案。1觀察8周齡mdx小鼠的血清學(xué)、病理學(xué)和肌力改變。選取8w雄性c57bl/10scsn-dmdmdx/jnju鼠(以下簡(jiǎn)稱mdx小鼠)為實(shí)驗(yàn)鼠(mdx組),8w雄性野生型小鼠(c57bl/10scsn小鼠)為對(duì)照鼠(wt組)。每組選取10只,5只用于前肢握力檢測(cè)及留取血清標(biāo)本;5只用于后肢肌力檢測(cè)及常規(guī)組織化學(xué)染色。選取5只小鼠,測(cè)量前肢抓力,然后以10%水合氯醛(350mg/kg體重)腹腔注射麻醉,摘除小鼠眼球取血,留取血清標(biāo)本,用于血清ck值測(cè)定;另外選取5只小鼠,以10%水合氯醛(350mg/kg體重)腹腔注射麻醉,分離脛骨前肌,對(duì)其收縮功能進(jìn)行原位分析,分析完成后,移除脛骨前肌稱重。取小鼠脛骨前肌進(jìn)行包埋冰凍處理或直接冰凍處理。通過冰凍切片的常規(guī)染色(he染色)觀察肌組織病理改變,并對(duì)肌纖維再生及壞死情況進(jìn)行評(píng)估。2觀察aav9介導(dǎo)的vegf基因過表達(dá)對(duì)mdx小鼠的影響。2.1驗(yàn)證在本實(shí)驗(yàn)室條件下aav9所攜帶基因能在小鼠體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。選取3對(duì)6w同窩雄性野生型小鼠,3只未給予任何處理,作為空白對(duì)照;3只給予aav9-gfp(150ul/只1x1012vg/ml)尾靜脈注射,單次注射后3周,在激光共聚焦顯微鏡下觀察肌肉組織中綠色熒光蛋白gfp(greenfluorescentprotein,gfp)的表達(dá)情況。2.2選取6w雄性野生型小鼠為正常對(duì)照組(wt組);選取6w雄性mdx小鼠,分為兩組:mdx組(不給與任何處理),aav9-vegf組(給予aav9-vegf150ul/只,尾靜脈注射),每組5只小鼠。單次給藥后觀察4w,在小鼠10w時(shí)對(duì)其進(jìn)行肌損傷程度的定量評(píng)估。評(píng)估方法同上。應(yīng)用spss13.0系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果:18wmdx小鼠的血清學(xué)、病理學(xué)和肌力改變。1.1血清ck水平:mdx小鼠血清ck水平較wt組明顯升高。1.2肌肉病理:he染色中,mdx小鼠脛骨前肌、腓腸肌及膈肌中心核肌纖維比例與wt組相比明顯升高。mdx小鼠脛骨前肌、膈肌肌纖維最小feret直徑變異度明顯大于wt組。mdx小鼠脛骨前肌、腓腸肌及膈肌炎癥壞死區(qū)域占總面積的百分比明顯高于wt組。1.3肌力:小鼠抓力測(cè)試中,mdx小鼠5次重復(fù)測(cè)量的肌力均小于wt組;第5次測(cè)量的肌力和第1次測(cè)量的肌力相比,其下降的百分率約為56%,明顯高于wt組。脛骨前肌收縮功能的原位分析:在不同頻率下mdx小鼠所測(cè)定的最大強(qiáng)直收縮力均小于wt組;連續(xù)9次離心收縮后所測(cè)得的最大等長(zhǎng)收縮力和初始的最大等長(zhǎng)收縮力相比,其下降的百分率約為80%,明顯高于wt組。2aav9介導(dǎo)vegf基因過表達(dá)改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能。2.1wt組小鼠經(jīng)尾靜脈注射aav9-gfp后,觀察到其肌肉組織中有綠色熒光蛋白的表達(dá)。驗(yàn)證了在本實(shí)驗(yàn)室條件下aav9可以成功的轉(zhuǎn)染肌細(xì)胞并表達(dá)所攜帶的基因。2.2westrenblotting結(jié)果表明與wt組、mdx組相比,aav9-vegf組小鼠肌肉組織中vegf含量升高。2.3aav9-vegf組、mdx組、wt組肌肉損傷程度定量比較。2.3.1血清ck水平:aav9-vegf組血清ck水平(46249.5u/l)較mdx組降低(73418u/l),較wt組升高(2746.5u/l),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3.2肌肉病理:he染色中,aav9-vegf組小鼠炎癥壞死區(qū)域占總面積的百分比為0.992±0.22%,低于mdx組,高于wt組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;aav9-vegf組再生肌纖維數(shù)目占總纖維數(shù)的百分比27.97±3.3%,高于mdx組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高于wt組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3.3肌力:aav9-vegf組小鼠5次重復(fù)測(cè)量的肌力均小于wt組,大于mdx組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;第5次測(cè)量的肌力和第1次測(cè)量的肌力相比,aav9-vegf組下降的百分率約為57%,高于wt組,低于mdx組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:vegf能在一定程度上改善mdx小鼠的肌組織損傷,為dmd提供了新的治療方向,如何使vegf發(fā)揮最佳作用還需我們進(jìn)一步探索。
【關(guān)鍵詞】：DMD AAV9 VEGF mdx小鼠 肌肉病理 肌力
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R746.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-17
• 材料與方法17-26
• 結(jié)果26-28
• 附圖28-36
• 附表36-37
• 討論37-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 綜述 VEGF發(fā)揮生物學(xué)功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制46-60
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 致謝60-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷61

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