本文關(guān)鍵詞：犬子宮蓄膿內(nèi)參基因及候選基因差異表達(dá)研究

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【摘要】：犬子宮蓄膿是一種小動物臨床常見病之一,多由子宮內(nèi)膜的病變而引起,而子宮內(nèi)膜的病變又與多種生長因子及其受體數(shù)量密切相關(guān)。目前,對本病的研究己進(jìn)入分子生物學(xué)水平,其中不同生長因子對犬子宮內(nèi)膜的作用機(jī)理尚不清楚,因此,本研究探索了在子宮蓄膿中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,之后運(yùn)用篩選出的穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)GF-2(胰島素樣生長因子2,insulin-like growth factor2,IGF2)和IGF1R(胰島素樣生長因子1受體,insulin-like growth factor1 receptor)的m RNA表達(dá)進(jìn)行了分析,同時分析了蛋白在犬子宮組織中的表達(dá)情況。本研究中使用了7個候選內(nèi)參基因(18SrRNA.ACTB,B2M,GAPDH,HPRT,RPL13A,YWHAZ),通過GeNorm,Normfinder,Best Keeper和RefFinder軟件分析以及K.H.Sadek法分析這些內(nèi)參基因在正常及病變?nèi)訉m體組織中基因表達(dá)的穩(wěn)定性。最后,采用RT-qPCR使用最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)GF2和IGF1R的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。之后運(yùn)用免疫組化SP法在細(xì)胞水平上檢測IGF2和IGF1R于犬子宮蓄膿組織及正常子宮組織中的表達(dá)。采用Western blot法從蛋白水平上檢測IGF2和IGF1R在子宮蓄膿組織及正常子宮組織中的表達(dá)。綜合分析后,我們篩選到了所有樣品中,最穩(wěn)定的內(nèi)參基因YWHAZ。在正常與蓄膿組織中,選用不同的內(nèi)參基因,IGF1R的mRNA表達(dá)量有很大差異。當(dāng)選用不穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為內(nèi)參將會導(dǎo)致不準(zhǔn)確的分析結(jié)果,這進(jìn)一步證實(shí)了篩選內(nèi)參基因的有效性和必要性。IGF2和IGF1R蛋白的陽性表達(dá)均主要定位于細(xì)胞的胞漿中。IGF-2蛋白在子宮蓄膿組織中的表達(dá)量極顯著高于正常犬子宮內(nèi)膜組織(P0.01)。IGF-2的mRNA在子宮蓄膿組織中的表達(dá)水平極顯著高于正常犬子宮組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。IGF1R2蛋白在子宮蓄膿組織中的表達(dá)量極顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織(P0.01)。IGF1R的mRNA在子宮蓄膿組織中的表達(dá)水平均顯極著高于正常犬子宮組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。分析免疫組化結(jié)果顯示IGF-1R陽性表達(dá)的上調(diào)與IGF-2的異常高表達(dá)之間低度相關(guān)(r=0.423),Western Blotting結(jié)果顯示IGF-1R陽性表達(dá)的上調(diào)與IGF-2的異常高表達(dá)之間高度相關(guān)(r=0.927)。本研究篩選了正常犬與蓄膿犬子宮組織中最優(yōu)內(nèi)參基因,并檢測了子宮蓄膿對子宮組織中IGF2和IGF1R表達(dá)量的影響。該成果不但為今后犬子宮蓄膿疾病在分子方面的的研究提供了一定的理論基礎(chǔ),并且闡明了IGF2和IGF1R在該病發(fā)展過程中的相關(guān)性,有望為子宮蓄膿的臨床治療與預(yù)防提供新的研究方向。
【關(guān)鍵詞】：犬 內(nèi)參基因 IGF2 IGF1R
【學(xué)位授予單位】：天津農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.292
【目錄】：

• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 第一章 引言15-31
• 1 犬子宮蓄膿研究背景及意義15-24
• 1.1 母犬的發(fā)情周期及其特點(diǎn)15-16
• 1.2 犬子宮蓄膿概述16-17
• 1.3 發(fā)情周期與子宮蓄膿的關(guān)系17-18
• 1.4 發(fā)病有關(guān)因素18-19
• 1.5 發(fā)病機(jī)理19-20
• 1.6 臨床癥狀、病理變化及子宮蓄膿的分型20-22
• 1.7 檢查及診斷方法22
• 1.8 與其他組織器官的損傷22-23
• 1.9 治療方法23-24
• 2 熒光定量PCR24-27
• 2.1 熒光定量PCR24-25
• 2.2 內(nèi)參基因概述25
• 2.3 內(nèi)參基因篩選的軟件及方法25-27
• 2.4 內(nèi)參基因篩選的研究進(jìn)展27
• 3 IGF2與IGF1R結(jié)構(gòu)及功能的研究進(jìn)展27-29
• 3.1 IGF家族27-28
• 3.2 IGF家族在子宮疾病中的作用28-29
• 3.3 IGF2的結(jié)構(gòu)與功能29
• 3.4 IGF1R的結(jié)構(gòu)與功能29
• 4 本研究目的及意義29-31
• 第二章 犬子宮蓄膿子宮熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選31-47
• 1 材料31-32
• 1.1 子宮來源31
• 1.2 主要試劑31
• 1.3 主要儀器和設(shè)備31-32
• 2 方法32-35
• 2.1 犬子宮的采集和處理32
• 2.2 犬子宮內(nèi)膜的RNA提取32
• 2.3 RNA純度檢測32
• 2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄32-33
• 2.5 RT-q PCR33-34
• 2.6 引物設(shè)計(jì)34
• 2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作34
• 2.8 引物擴(kuò)增效率計(jì)算34
• 2.9 數(shù)據(jù)分析34-35
• 3 結(jié)果與分析35-44
• 3.1 RNA完整度及純度檢測結(jié)果35
• 3.2 基因的克隆35-36
• 3.3 引物特異性檢測及擴(kuò)增效率36-38
• 3.4 K.H.Sadek分析結(jié)果38-39
• 3.5 geNorm軟件分析結(jié)果39-42
• 3.6 NormFinder軟件分析結(jié)果42-43
• 3.7 Best Keeper軟件分析結(jié)果43
• 3.8 RefFinder分析結(jié)果43-44
• 3.9 IGF1R用不同內(nèi)參基因作為參考的相對表達(dá)量44
• 4 討論44-47
• 第三章 RT-qPCR法檢測犬子宮中IGF2和IGF1R的表達(dá)47-51
• 1 材料47
• 1.1 組織來源47
• 1.2 主要試劑47
• 1.3 主要儀器和設(shè)備47
• 2 方法47-48
• 2.1 犬子宮的采集和處理47
• 2.2 犬子宮內(nèi)膜的RNA提取47
• 2.3 RNA純度檢測47-48
• 2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄48
• 2.5 RT-q PCR48
• 2.6 引物設(shè)計(jì)48
• 2.7 統(tǒng)計(jì)分析48
• 3 結(jié)果與分析48-50
• 3.1 RNA完整度及純度檢測結(jié)果48
• 3.2 引物特異性檢測48-49
• 3.3 IGF1R和IGF2的相對表達(dá)量49-50
• 4 討論50-51
• 第四章 子宮蓄膿對犬子宮內(nèi)膜組織中IGF-2及IGF-1R蛋白表達(dá)的影響51-59
• 1 材料51-52
• 1.1 組織來源51
• 1.2 主要試劑51
• 1.3 主要儀器和設(shè)備51-52
• 2 方法52-53
• 2.1 免疫組織化學(xué)PV法檢測52
• 2.2 Western blotting檢測方法52-53
• 2.3 數(shù)據(jù)分析53
• 3 結(jié)果和分析53-57
• 3.1 免疫組化IGF-2 表達(dá)檢測結(jié)果53-54
• 3.2 免疫組化IGF-1R表達(dá)檢測結(jié)果54-55
• 3.3 IGF-2，IGF-1R Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-56
• 3.4 IGF-1R和IGF-2 表達(dá)的相關(guān)性56-57
• 4 討論57-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 致謝67-68
• 附錄68-71
• 附錄 1 中英文縮略詞匯表 Abbreviations table68-69
• 附錄 2 候選基因名稱，，功能、引物序列、產(chǎn)物長度、退火溫度及擴(kuò)增效率69-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文71

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