本文關(guān)鍵詞：烏頭GGPS基因克隆分析及雙酯型生物堿生物合成途徑分析

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【摘要】：附子是毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根加工品,具有回陽救逆,補(bǔ)火助陽,散寒止痛等功效,藥用及人工栽培歷史悠久,常被用于亡陽虛脫,肢冷脈微,虛寒吐瀉及脘腹冷痛等癥狀,有毒。附子藥用價(jià)值巨大,栽培歷史雖久,但目前生產(chǎn)上仍然采用“山區(qū)育種,壩區(qū)栽培”的傳統(tǒng)生產(chǎn)模式,栽培區(qū)每年引種的種源地都不固定,導(dǎo)致種源混亂及不穩(wěn)定,迄今為止沒有一個(gè)有效成分含量明顯增高的栽培新品種。附子的主要生物活性成分烏頭堿,在生物堿分類中屬于二萜類生物堿,本研究通過對二萜類化合物生物合成中的關(guān)鍵酶基因r{牛兒基r{牛兒基焦磷酸合酶基因(GGPS)進(jìn)行克隆及組織表達(dá)分析,同時(shí)通過HPLC對不同生長期、不同植物組織中主要的藥用活性烏頭堿：雙酯型生物堿(新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿)進(jìn)行含量檢測,預(yù)測了GGPS基因的功能,探討了烏頭GGPS基因?qū)τ诟阶又参矬w內(nèi)烏頭堿類生物堿生物合成的作用,為揭示烏頭堿類生物堿生物合成途徑奠定了基礎(chǔ),為通過生物技術(shù)的方法培育具有高烏頭堿含量的附子新品種提供了途徑。本研究主要得到了以下結(jié)果：1、烏頭GGPS基因的克隆：首次從附子種根組培材料中通過同源克隆的方式,結(jié)合RACE與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆得到了一個(gè)長為1420bp的cDNA序列,NCBI同源比對顯示其與芍藥丹參等物種GGPS基因同源性較高,與金盞花(Adonis aestivalis)同源性最高,達(dá)80%;ORF Finder顯示其CDS區(qū)長為861bp,編碼287個(gè)氨基酸；同源序列多重比對及分子系統(tǒng)進(jìn)化分析表明其具有GGPS基因共有的2個(gè)多聚異戊二烯基合酶的特異序列“LMHDDLPCMDNDDLRRG" "IGLLFQVVDDILD",以及全部5個(gè)保守域；預(yù)測到GGPS蛋白分子質(zhì)量為30.95kDa,等電點(diǎn)為5.24；亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示其主要在葉綠體中表達(dá),線粒體及其他部位也有少量表達(dá)；多維結(jié)構(gòu)分析顯示其結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占30.56%,α-螺旋占65.28%,p-折疊占4.17%;結(jié)構(gòu)比較顯示其三維結(jié)構(gòu)具有高度的保守性。2、GGPS基因在不同生長時(shí)期的表達(dá)：對所有材料的熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行不同生長時(shí)期的縱向比較,結(jié)果顯示,目的基因植株的不同生長時(shí)期都有不同程度的表達(dá)。具體到植物組織,不同植物組織在不同時(shí)期的表達(dá)量不同,表達(dá)峰值時(shí)期也有組織間差異,但總體來說就,其表達(dá)量與植株的生命代謝活動(dòng)的強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系。3、GGPS基因在不同組織中的表達(dá)：GGPS基因在各組織中表達(dá)量差異較大。在生長旺盛期,組織間表達(dá)量比較為葉莖根須根。4、有效成分在不同組織中的含量：在每個(gè)批次的不同組織樣品中都檢測出了烏頭堿,說明了在附子植株中烏頭堿的合成部位并不僅限于根部,而是植株各個(gè)組織都有合成,但含量卻不一樣,從本研究結(jié)果來看,植株不同組織間烏頭堿含量高低依次為須根子須根根子根葉莖。5、有效成分在不同生長時(shí)期的含量：在不同生長時(shí)期附子烏頭堿含量檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,不同組織在不同生長時(shí)期的含量不同,且線性關(guān)系也不一樣,葉和根中含量隨時(shí)間呈先升高后降低的趨勢,莖中烏頭堿含量一直升高,而須根中的烏頭堿含量隨時(shí)間變化不大。6、GGPS基因與烏頭堿生物合成的關(guān)系：對于GGPS基因的表達(dá)及烏頭堿含量分析發(fā)現(xiàn),烏頭堿的合成與目的基因的表達(dá)在植株部位上高度一致,且其表達(dá)強(qiáng)度隨時(shí)間的趨勢與烏頭堿含量動(dòng)態(tài)變化隨時(shí)間的趨勢一致,雙變量相關(guān)性分析顯示相關(guān)系數(shù)為0.993,表明在0.01水平上顯著相關(guān),說明了烏頭堿的合成與GGPS基因的表達(dá)密切相關(guān),從而可以推斷得知烏頭堿的生物合成與二萜代謝途徑有關(guān)、其生物合成途徑為從二萜到二萜生物堿的結(jié)論。
【關(guān)鍵詞】：烏頭 GGPS 基因克隆 qPCR 雙酯型生物堿含量
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S567
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略詞表9-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-19
• 1.1 附子及其生物活性研究13-14
• 1.2 二萜生物堿研究14-16
• 1.3 植物GGPS基因研究16-17
• 1.4 植物基因克隆17
• 1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR17-18
• 1.6 烏頭堿類生物堿檢測18
• 1.7 研究目的及意義18-19
• 2 材料與方法19-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.1.1 植物材料19-20
• 2.1.2 質(zhì)粒、菌株20
• 2.1.3 試劑20-21
• 2.1.4 儀器與設(shè)備21
• 2.1.5 引物合成與序列測定21
• 2.2 GGPS基因全長克隆21-29
• 2.2.1 組織培養(yǎng)21-22
• 2.2.2 合成cDNA第一鏈22-23
• 2.2.3 簡并引物設(shè)計(jì)23-24
• 2.2.4 核心序列PCR擴(kuò)增24-26
• 2.2.5 3'RACE26-28
• 2.2.6 基因全長PCR擴(kuò)增28-29
• 2.2.7 GGPS基因生物信息學(xué)分析29
• 2.3 基因組織表達(dá)分析29-34
• 2.3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄29-31
• 2.3.2 qPCR引物設(shè)計(jì)31-32
• 2.3.3 半定量PCR32-33
• 2.3.4 qPCR33-34
• 2.4 雙酯型生物堿含量分析34-37
• 2.4.1 色譜條件34
• 2.4.2 提取方法34
• 2.4.3 方法學(xué)考察34-36
• 2.4.4 含量測定36-37
• 2.5 相關(guān)性分析37
• 3 結(jié)果與分析37-58
• 3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄37-38
• 3.2 GGPS基因克隆38-40
• 3.2.1 組織培養(yǎng)38
• 3.2.2 核心序列擴(kuò)增38-39
• 3.2.3 3'RACE39-40
• 3.2.4 基因全長擴(kuò)增40
• 3.3 GGPS生物信息學(xué)分析40-46
• 3.3.1 序列比對40-41
• 3.3.2 蛋白質(zhì)翻譯41-43
• 3.3.3 多重序列比對43-44
• 3.3.4 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析44-45
• 3.3.5 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與3D結(jié)構(gòu)預(yù)測45-46
• 3.4 GGPS基因組織表達(dá)分析46-51
• 3.4.1 內(nèi)參基因核心片段的獲得及引物設(shè)計(jì)46-47
• 3.4.2 半定量PCR47-48
• 3.4.3 qPCR48-51
• 3.5 雙酯型生物堿含量分析51-57
• 3.5.1 方法學(xué)考察51-55
• 3.5.2 含量測定分析55-57
• 3.6 相關(guān)性分析57-58
• 4 討論及結(jié)論58-60
• 4.1 烏頭GGPS基因克隆58
• 4.2 烏頭GGPS基因的表達(dá)分析58-59
• 4.3 烏頭烏頭堿含量分析59
• 4.4 烏頭GGPS基因與烏頭堿生物合成59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 致謝66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 呂佳韻;彭成;;甘草酸與烏頭堿配伍對神經(jīng)細(xì)胞的作用[J];中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2013年07期

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本文編號：687657