本文關(guān)鍵詞：炭樣小單孢菌JXNU-1中抗生素合成相關(guān)基因篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：炭樣小單孢菌JXNU-1是本實驗室從土壤中篩選得到的一株具有廣譜抗菌活性的稀有放線菌。前期研究已建立了從該菌發(fā)酵液中分離純化抗生素的方法,并經(jīng)分析初步確定其抗生素為一核苷類抗生素,但有關(guān)炭樣小單孢菌JXNU-1中抗生素的生物合成機制仍不清楚。本文采用組學(xué)方法篩選炭樣小單孢菌JXNU-1中抗生素生物合成相關(guān)基因(簇),具體內(nèi)容和結(jié)果如下:1.以優(yōu)化SDS法提取炭樣小單孢菌JXNU-1基因組DNA,采用高通量測序技術(shù)對基因組DNA測序,利用SOAPdenovo軟件組裝,人工PCR修補基因組部分缺口,然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析,最終獲得炭樣小單孢菌JXNU-1全基因組精細(xì)圖,相關(guān)序列已提交GenBank,獲得登錄號為JXSX00000000;2.以RNAiso試劑法提取發(fā)酵36 h(抗生素分泌前)和發(fā)酵108 h(抗生素分泌后)炭樣小單孢菌JXNU-1總RNA,分別構(gòu)建抗生素分泌前后的cDNA文庫,采用Illumina Hiseq 2500測序平臺對cDNA文庫測序,序列已提交到NCBI SRA,獲得登錄號SRP066689;基于cDNA文庫測序結(jié)果,得到炭樣小單孢菌JXNU-1抗生素分泌后與分泌前的差異表達(dá)基因1072個,其中上調(diào)表達(dá)基因573個,下調(diào)表達(dá)基因499個。將抗生素分泌過程中表達(dá)顯著上調(diào)的30個基因定位到炭樣小單孢菌JXNU-1全基因組的13基因簇中,經(jīng)分析初步確定基因簇cluster12為炭樣小單孢菌JXNU-1中抗生素合成相關(guān)基因(簇);3.以發(fā)酵108 h的炭樣小單孢菌JXNU-1菌體為實驗組(Tester),發(fā)酵36h的菌體為驅(qū)動組(Driver),分別提取總RNA、合成雙鏈cDNA,進(jìn)行抑制性消減雜交,成功構(gòu)建炭樣小單孢菌JXNU-1發(fā)酵分泌抗生素前后的消減cDNA文庫,選取部分陽性克隆進(jìn)行測序,獲得差異片段26個,從中篩選得到與抗生素生物合成密切相關(guān)基因5個(經(jīng)熒光定量PCR驗證)。根據(jù)炭樣小單孢菌JXNU-1全基因組序列,上述5個基因被定位到4個基因簇中,且分析確定基因簇cluster 2極可能為炭樣小單孢菌JXNU-1中抗生素合成基因(簇);4.經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄組測序分析得到的基因簇cluster 12與抑制性消減雜交技術(shù)分析得到的cluster 2實際為同一基因簇,可以確定為炭樣小單孢菌JXNU-1中抗生素生物合成基因簇,cluster 2序列已提交Gene Bank,獲得登錄號KU355271;上述研究結(jié)果為闡明炭樣小單孢菌JXNU-1中抗生素生物合成的代謝通路及調(diào)控機制提供了實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：炭樣小單孢菌 全基因組序列分析 轉(zhuǎn)錄組分析 抑制性消減雜交 抗生素生物合成基因簇
【學(xué)位授予單位】：江西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q933
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮略語7-11
• 1 緒論11-23
• 1.1 炭樣小單孢菌研究概況11
• 1.2 核苷類抗生素11-17
• 1.2.1 概念11-12
• 1.2.2 種類12-13
• 1.2.3 生物合成基因簇13-17
• 1.3 新一代高通量測序技術(shù)的應(yīng)用17-18
• 1.3.1 在DNA水平上的應(yīng)用17
• 1.3.2 在RNA水平上的應(yīng)用17-18
• 1.4 原核生物差異表達(dá)基因的篩選方法18-21
• 1.4.1 代表性差異分析技術(shù)18-19
• 1.4.2 限制性酶切片段差異顯示19
• 1.4.3 cDNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性19
• 1.4.4 cDNA微陣列19-20
• 1.4.5 抑制性消減雜交技術(shù)20-21
• 1.5 研究目的和意義21-23
• 2 炭樣小單孢菌JXNU-1 全基因組序列分析23-39
• 2.1 實驗材料23-25
• 2.1.1 菌種23
• 2.1.2 培養(yǎng)基23
• 2.1.3 主要藥品和試劑23-24
• 2.1.4 試劑及其配制24-25
• 2.2 實驗方法25-27
• 2.2.1 炭樣小單孢菌JXNU-1 的培養(yǎng)25
• 2.2.2 基因組DNA提取25-26
• 2.2.3 凝膠電泳檢測26
• 2.2.4 基因組測序、組裝26
• 2.2.5 基因組組分分析26-27
• 2.2.6 基因組功能分析27
• 2.2.7 基因組比較分析27
• 2.2.8 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測27
• 2.3 結(jié)果與分析27-38
• 2.3.1 基因組DNA提取27-28
• 2.3.2 基因組概況28-30
• 2.3.3 基因預(yù)測30-31
• 2.3.4 基因組功能注釋31-34
• 2.3.5 共線性分析34-36
• 2.3.6 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇36-37
• 2.3.7 全基因組序列提交37-38
• 2.4 本章小結(jié)38-39
• 3 炭樣小單孢菌JXNU-1 的比較轉(zhuǎn)錄組分析39-55
• 3.1 實驗材料39-40
• 3.1.1 菌種39
• 3.1.2 培養(yǎng)基39-40
• 3.1.3 實驗儀器和設(shè)備40
• 3.2 實驗方法40-42
• 3.2.1 炭樣小單孢菌JXNU-1 的培養(yǎng)40-41
• 3.2.2 樣品取樣及活性檢測41
• 3.2.3 總RNA提取41-42
• 3.2.4 RNA樣品質(zhì)量檢測42
• 3.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序42
• 3.3 結(jié)果與分析42-52
• 3.3.1 樣品活性檢測42-43
• 3.3.2 總RNA提取43-44
• 3.3.3 轉(zhuǎn)錄組分析44-46
• 3.3.4 差異表達(dá)基因統(tǒng)計46
• 3.3.5 差異表達(dá)基因功能注釋46-49
• 3.3.6 抗生素合成相關(guān)基因篩選49-52
• 3.3.7 轉(zhuǎn)錄組序列提交52
• 3.4 本章小結(jié)52-55
• 4 應(yīng)用SSH技術(shù)篩選炭樣小單孢菌JXNU-1 中抗生素合成相關(guān)基因55-85
• 4.1 實驗材料55-57
• 4.1.1 菌種55
• 4.1.2 主要分子生物學(xué)試劑55-56
• 4.1.3 引物和接頭序列56
• 4.1.4 試劑及其配制56-57
• 4.1.5 培養(yǎng)基57
• 4.2 實驗方法57-72
• 4.2.1 炭樣小單孢菌JXNU-1 的培養(yǎng)57
• 4.2.2 樣品取樣及活性檢測57
• 4.2.3 總RNA提取57
• 4.2.4 DNA去除57-58
• 4.2.5 雙鏈cDNA合成58-61
• 4.2.6 抑制消減雜交61-68
• 4.2.7 SSH cDNA文庫構(gòu)建及克隆篩選68-70
• 4.2.8 陽性克隆測序及分析70
• 4.2.9 實時熒光定量70-72
• 4.3 結(jié)果與分析72-83
• 4.3.1 雙鏈c DNA檢測72-73
• 4.3.2 Rsa I酶切結(jié)果73-74
• 4.3.3 接頭連接效率分析74-75
• 4.3.4 抑制消減雜交結(jié)果75-76
• 4.3.5 抑制性消減效率的檢測76
• 4.3.6 差異表達(dá)基因的多樣性鑒定76-77
• 4.3.7 差異片段序列檢索分析77-78
• 4.3.8 抗生素生物合成相關(guān)基因篩選78-80
• 4.3.9 抗生素合成相關(guān)基因簇篩選80-82
• 4.3.10 基因簇序列提交82-83
• 4.4 討論83
• 4.5 本章小結(jié)83-85
• 5 結(jié)論與展望85-87
• 5.1 結(jié)論85-86
• 5.2 展望86-87
• 參考文獻(xiàn)87-97
• 附錄I97-101
• 致謝101-102
• 在讀期間公開發(fā)表論文（著）及科研情況102
• 已發(fā)表的論文102
• 參與的科研項目102

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