本文關(guān)鍵詞：Sm22α基因敲除小鼠繁育新方法的建立及在宮縮乏力研究中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:平滑肌22α(smooth muscle 22α,SM22α)是一種分子量22k Da的actin結(jié)合蛋白,用于血管平滑肌細(xì)胞分化及表型轉(zhuǎn)化的研究。Sm22α基因敲除(Sm22α~(-/-))小鼠在人類相關(guān)疾病的研究中已得到廣泛應(yīng)用。然而,Sm22α~(-/-)小鼠的傳統(tǒng)繁育方法產(chǎn)生的純合型子代數(shù)量較少,且易出現(xiàn)宮內(nèi)窘迫,引起母、胎鼠死亡,無法滿足相關(guān)研究的需要。本文欲對Sm22α~(-/-)小鼠的傳統(tǒng)繁育方法進(jìn)行改進(jìn),提高子代小鼠的純合率,進(jìn)而初步探討宮內(nèi)窘迫發(fā)生的機制。方法:1 Sm22α~(-/-)小鼠純合子繁育方法的改進(jìn)采用純合子交配方式即雄性純合子與雌性純合子交配,并對有分娩征兆的孕鼠實施剖腹產(chǎn)手術(shù),剖出的仔鼠由ICR雌鼠代乳。同時用傳統(tǒng)的雜合子交配方式即雄性純合子與雌性雜合子交配作為對照,比較兩種繁育方式的雌鼠受孕率及產(chǎn)生仔鼠的斷乳后存活率。2子代小鼠基因型鑒定利用化學(xué)消化法提取兩種交配方式產(chǎn)生的子代小鼠的基因組DNA,聚合酶連式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)擴增相應(yīng)目的片段;PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,紫外凝膠成像儀下分析小鼠基因型并計算兩種繁育方法產(chǎn)生子代的純合率。3 SM22α對子宮平滑肌發(fā)育的影響解剖分離野生型(Sm22α~(+/+))雌鼠與Sm22α~(-/-)雌鼠的子宮,觀察比較其大體形態(tài);通過組織冰凍切片HE染色,觀察子宮壁的形態(tài)結(jié)構(gòu),應(yīng)用圖像分析軟件計算子宮中膜平滑肌肌層相對厚度(中膜肌層厚度與子宮壁厚度的比值),進(jìn)而探討敲除Sm22α對子宮平滑肌發(fā)育的影響。4 SM22α對子宮平滑肌細(xì)胞骨架F-actin形成的影響應(yīng)用偶聯(lián)熒光基團的鬼筆環(huán)肽分別對野生型及Sm22α~(-/-)小鼠的子宮平滑肌組織中的F-actin進(jìn)行冰凍切片熒光染色,熒光顯微鏡下觀察熒光強度,進(jìn)而定量分析F-actin的含量。5子宮平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定為了在細(xì)胞水平探討SM22α在子宮平滑肌收縮中的作用,應(yīng)用改良組織貼塊法培養(yǎng)野生型及Sm22α~(-/-)小鼠子宮平滑肌細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長特點并用特異性平滑肌肌動蛋白(smooth muscleα-actin,SMα-actin)的免疫熒光染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。6 SM22α對子宮平滑肌細(xì)胞中應(yīng)力纖維形成的影響為了進(jìn)一步驗證SM22α在actin聚合中的作用,分別對野生型及Sm22α~(-/-)小鼠的子宮平滑肌細(xì)胞中應(yīng)力纖維及SM22α進(jìn)行熒光染色分析,觀察二者的共定位情況并分析敲除Sm22α基因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞中應(yīng)力纖維形成的影響。7統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。計數(shù)資料以百分率表示,采用χ2檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1純合子繁育方式與傳統(tǒng)雜合子繁育方式相比,雌鼠受孕率分別為50%和60%,仔鼠斷乳后存活率分別為87.70%和88.60%,且兩種繁育方式相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);2純合子繁育方式與傳統(tǒng)雜合子繁育方式產(chǎn)生子代的純合子率分別為100%和47%,基本符合孟德爾遺傳定律;3與野生型相比,Sm22α~(-/-)雌鼠子宮大體形態(tài)無明顯差異,但其中膜平滑肌肌層相對厚度較小,與野生型相比具有顯著差異(P0.05);4組織熒光染色結(jié)果顯示,Sm22α~(-/-)小鼠與野生型小鼠相比子宮平滑肌纖維中細(xì)胞骨架蛋白F-actin的相對含量偏低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),這表明SM22α影響actin的聚合;5成功培養(yǎng)野生型與Sm22α~(-/-)小鼠原代子宮平滑肌細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為梭形并呈典型的“峰-谷”樣生長;特異性的SMα-actin免疫熒光染色顯示,單層細(xì)胞中陽性細(xì)胞率在95%以上;6子宮平滑肌細(xì)胞應(yīng)力纖維熒光染色結(jié)果顯示,在野生型小鼠子宮平滑肌細(xì)胞中,應(yīng)力纖維呈束狀,平行排列,SM22α與應(yīng)力纖維共定位;而Sm22α~(-/-)小鼠的子宮平滑肌細(xì)胞中,應(yīng)力纖維稀疏,呈散在分布;這表明SM22α在應(yīng)力纖維形成過程中具有重要作用。結(jié)論:1純合子繁育方式不僅增加了子代純合子的數(shù)量,且無需基因型鑒定。2 Sm22α缺失可導(dǎo)致子宮平滑肌F-actin形成障礙,進(jìn)而降低子宮平滑肌收縮性。
【關(guān)鍵詞】：SM22α 基因敲除 繁育 宮內(nèi)窘迫 肌動蛋白聚合
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-19
• 結(jié)果19-21
• 附圖21-25
• 附表25-26
• 討論26-29
• 結(jié)論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-33
• 綜述 肌動蛋白動力學(xué)與平滑肌收縮33-49
• 參考文獻(xiàn)41-49
• 致謝49-50
• 個人簡歷50

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本文編號：458220