本文關(guān)鍵詞：DENV-2對原代HHSECs凋亡，自噬及其相關(guān)基因表達的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究Ⅱ型登革病毒(DENV-2)感染原代人肝竇內(nèi)皮細胞(HHSEC)后,HHSECs的凋亡、自噬情況,以及ICAM-1和Beclin-1 mRNA水平的表達,并分析它們在登革病毒致病過程中可能的機制。方法:通過流式細胞術(shù)檢測細胞膜表面CD31分子;免疫組化法檢測細胞漿Ⅷ因子的表達,以鑒定HHSECs。RT-PCR擴增DENV-2 NS1基因部分序列,鑒定病毒;根據(jù)NS1的序列設(shè)計酶切位點,HindⅢ酶切,預(yù)期酶切片段大小為228bp和185bp,對病毒進一步鑒定;測定DENV-2對C6/36細胞的TCID50。以105TCID50的DENV-2作用于HHSECs,實時熒光定量PCR動態(tài)檢測DENV-2 NS1部分序列,以觀察HHSECs受DENV-2感染的情況;CCK8法動態(tài)觀察受感染細胞的損傷情況并計算其抑制率。實時熒光定量PCR動態(tài)檢測被DENV-2感染的HHSECs的ICAM-1及Beclin-1(自噬相關(guān)基因)mRNA水平的表達。流式細胞術(shù)檢測被DENV-2感染后的HHSECs細胞凋亡率,LC3B(自噬相關(guān)蛋白)以及ICAM-1的表達。結(jié)果:細胞呈梭形,生長良好,輪廓清晰,“鵝卵石”樣排列;免疫組化法檢測HHSECsⅧ因子的表達,DAB染色后與空白對照對比,可見細胞漿含棕黃色的顆粒;流式細胞儀檢測CD31表達率87.1%,符合HHSECs的特點。RT-PCR擴增DENV-2NS1基因部分序列,擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定,長度在400bp左右,與預(yù)期長度413bp一致,證實為DENV-2 NS1部分基因序列;HindⅢ酶切得到兩條酶切片段,長度在200bp左右,和預(yù)期一致;DENV-2毒株對C6/36細胞的TCID50為10-6.845/ml。Real time PCR檢測HHSECs中NS1基因mRNA的表達:未感染組不表達NS1基因;DENV-2作用于HHSECs后,表達DEN V-2 NS1 mRNA,DENV-2可感染HHSECs并在其中增殖,且于36h達峰值,以12h為對照,計算2-△△Ct值為11.33±1.77(P0.05)。病毒作用細胞后,CCK8法檢測DENV-2對細胞的毒性作用,細胞與未感染組有差別,不同時間點抑制率分別為10.9%±1.24%(12h),16.4%±0.42%(24h),17.0%±0.46%(36h),29.6%±0.26(48h)。流式細胞術(shù)動態(tài)觀察被DENV-2感染的HHSEC凋亡情況,12h的凋亡率為13.17%,最為明顯;之后逐漸減少,24h、36h和48h分別為4.31%,3.909%和2.975%。流式細胞術(shù)動態(tài)檢測被DENV-2感染的HHSECs,其LC3B的表達于36h達到峰值,表達率為35.5%;12h,24h和48h LC3B的表達率,分別為17.0%,22.3%和20.8%。流式細胞術(shù)動態(tài)檢測被DENV-2感染的HHSECs表面ICAM-1表達,12h,24h,36h和48h分別為9.17%,14.7%,12.7%,11.6%。Real time PCR檢測HHSECs中相關(guān)基因mRNA的表達水平:Beclin1及ICAM-1 mRNA在24h達峰值,以未感染組為對照,2-△△Ct值分別為46.77±2.55和40.97±4.91,爾后逐漸下降。結(jié)論:HHSEC對DENV-2易感;且DENV-2對HHSECs生長有抑制作用;并可誘導ICAM-1上調(diào),激活HHSECs。這或許可以成為探究登革病毒致病機制的新模型。HHSEC被DENV-2感染后,LC3B及Beclin1的表達增高;DENV-2感染早期可誘導HHSECs的細胞凋亡、自噬。提示細胞自噬和凋亡參與DENV感染過程,具體機制有待研究。
【關(guān)鍵詞】：Ⅱ型登革病毒 人肝竇內(nèi)皮細胞 凋亡 自噬 Beclin-1 ICAM-1
【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 略縮詞表9-10
• 引言10-12
• 材料與方法12-24
• 結(jié)果24-34
• 討論34-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-47
• 附錄47-48
• 綜述48-57
• 參考文獻52-57
• 作者簡歷57-58
• 致謝58-59
• 學位論文數(shù)據(jù)集59

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本文編號：458224