本文關(guān)鍵詞：西瓜噬酸菌基因Aave-3192、Aave-2108和Aave-4679、Aave-2716的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的西瓜噬酸菌的Tn5插入突變體庫進(jìn)行篩選,從中獲得2株致病性喪失、群體感應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)、胞外多糖的產(chǎn)量下降并喪失煙草過敏性反應(yīng)的菌株,分別為166和167。進(jìn)一步通過亞克隆技術(shù),獲得了這2株菌株的Tn5插入位置,其插入基因分別為Aave-3192和Aave-2108,這兩個(gè)基因分別編碼Hypothetical protein和Methyl-accepting chemotaxis sensory transducer。通過基因互補(bǔ)的方法構(gòu)建插入突變菌株的互補(bǔ)菌株,互補(bǔ)菌株的生物學(xué)測(cè)定結(jié)果表明,互補(bǔ)菌株的致病能力恢復(fù),游動(dòng)性,群體感應(yīng)能力,胞外多糖的產(chǎn)量,生物膜的形成能力等功能也部分恢復(fù),證明這兩個(gè)基因都與西瓜噬酸菌的致病性相關(guān)。已有研究表明,西瓜噬酸菌存在遺傳分化,目前將西瓜噬酸菌分為兩個(gè)亞群,這兩個(gè)亞群的菌株在生物學(xué)特性方面存在較大的差異。本研究通過西瓜噬酸菌全基因組序列,設(shè)計(jì)16對(duì)菌毛基因引物,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,有4對(duì)引物只能擴(kuò)增出亞群Ⅱ菌株菌毛基因；于是,對(duì)其中的兩個(gè)菌毛基因Aave-4679 (pilA)和Aave-2716 (pill)進(jìn)行定點(diǎn)突變,探討其功能,結(jié)果表明,菌毛基因pilA缺失后病菌的致病性下降,生物膜形成能力下降,游動(dòng)性減弱,群體感應(yīng)喪失,NA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)發(fā)生變化,無菌裙產(chǎn)生,但有煙草過敏反應(yīng)；而pill基因缺失后病菌的游動(dòng)性下降,在NA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)上較野生菌菌裙寬度變窄,而致病性、生物膜的形成能力等生物學(xué)特性與野生菌株一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了pilA與西瓜噬酸菌的致病性有關(guān),而pill與致病性無關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：西瓜噬酸菌 Tn5轉(zhuǎn)座子 基因敲除 基因互補(bǔ) 菌毛基因
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S432.42
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 1 前言9-16
• 1.1 西瓜細(xì)菌性果斑病研究概況9-14
• 1.1.1 病原菌的生物學(xué)特征及分類地位10-11
• 1.1.2 病原檢測(cè)研究進(jìn)展11
• 1.1.3 致病機(jī)理研究進(jìn)展11-13
• 1.1.4 遺傳多樣性研究13-14
• 1.2 本研究的目的意義14-16
• 2 致病相關(guān)基因Aave-3192和Aave-2108的功能研究16-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-18
• 2.1.1 供試菌株和質(zhì)粒16
• 2.1.2 供試西瓜、甜瓜和煙草品種16
• 2.1.3 培養(yǎng)基16-17
• 2.1.4 抗生素及工作濃度17
• 2.1.5 試劑17
• 2.1.6 主要儀器17
• 2.1.7 引物17-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 2.2.1 西瓜噬酸菌特異性和Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變的PCR驗(yàn)證18-19
• 2.2.2 突變株的生物學(xué)測(cè)定19-20
• 2.2.3 亞克隆定位Tn5插入位點(diǎn)20-21
• 2.2.4 互補(bǔ)菌株構(gòu)建21-23
• 2.2.5 互補(bǔ)菌株的生物學(xué)測(cè)定23-24
• 2.3 結(jié)果和分析24-35
• 2.3.1 西瓜噬酸菌特異性和Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變驗(yàn)證24-25
• 2.3.2 突變株的生物學(xué)測(cè)定25-27
• 2.3.3 亞克隆子驗(yàn)證27
• 2.3.4 亞克隆測(cè)序分析轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)27-28
• 2.3.5 互補(bǔ)載體的構(gòu)建28-30
• 2.3.6 互補(bǔ)菌株的獲得30-31
• 2.3.7 互補(bǔ)菌株的生物學(xué)測(cè)定31-35
• 2.4 小結(jié)和討論35-37
• 3 西瓜噬酸菌菌毛特異基因的初探37-53
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料37-39
• 3.1.1 菌株和質(zhì)粒37
• 3.1.2 試劑37
• 3.1.3 主要儀器37-38
• 3.1.4 引物38-39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法39-43
• 3.2.1 菌株的培養(yǎng)39
• 3.2.2 西瓜噬酸菌基因組DNA及質(zhì)粒的提取39
• 3.2.3 菌毛基因PCR擴(kuò)增篩選39-40
• 3.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)40
• 3.2.5 構(gòu)建自殺敲除載體40-42
• 3.2.6 基因的敲除及驗(yàn)證42
• 3.2.7 缺失菌株的生物學(xué)測(cè)定42-43
• 3.3 結(jié)果和分析43-51
• 3.3.1 菌毛特異性基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)43-44
• 3.3.2 敲除載體的獲得44-47
• 3.3.3 基因缺失菌株的獲得47-48
• 3.3.4 缺失突變株的生物學(xué)測(cè)定48-51
• 3.4 小結(jié)與討論51-53
• 4 結(jié)論與討論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 附錄Ⅰ 基因組DNA的提取步驟59
• 附錄Ⅱ 質(zhì)粒DNA提取步驟59-60
• 附錄Ⅲ DNA回收純化60
• 附錄Ⅳ 轉(zhuǎn)化60-61
• 致謝61

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