本文關(guān)鍵詞：柱花草膠孢炭疽菌致病缺陷突變體的篩選及其相關(guān)基因的克隆，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：柱花草(Stylosanthes spp.),是全球熱帶地區(qū)栽培面積最大應(yīng)用最廣泛的優(yōu)良豆科牧草。柱花草炭疽病(Stylo anthracnose)是柱花草生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害,該病主要由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起。本研究在實驗室已構(gòu)建出的膠孢炭疽菌T-DNA插入突變體庫的基礎(chǔ)上,篩選致病性缺陷突變菌株,通過Tail-PCR法克隆插入位點側(cè)翼序列,利用生物信息學(xué)比對分析,研究T-DNA插入位點基因,利用Split Marker法構(gòu)建基因敲除載體,驗證基因功能,從分子水平上對病原菌致病基因進(jìn)行克隆和功能分析,以研究其致病機理,希望能夠?qū)χ贫ǹ茖W(xué)的炭疽病防治策略,培育持久性抗病柱花草品種,提供一定的分子基礎(chǔ)及理論依據(jù)。(1)對本實驗室構(gòu)建的柱花草膠孢炭疽菌CH008 T-DNA插入突變體庫篩選,獲得致病缺陷突變體11株,包括致病性喪失突變體8株,為952、994、995、1171、1250、1338、1869、2508,致病性減弱突變體3株,為1681、1980、2638。PCR檢測顯示,T-DNA穩(wěn)定插入到11株致病缺陷突變體菌株的基因組中；Southern印記雜交結(jié)果表明,菌株1250及2508為雙拷貝,其余9株菌株均為單拷貝。(2)對致病缺陷突變體進(jìn)行生物學(xué)性狀分析,結(jié)果表明,突變菌株952、1980、2508與野生型CH008菌落形態(tài)具有差異性；突變菌株952、994、1338、1869、1980、2508生長速率明顯降低；突變菌株1250、1338、1681、1869、1980、2508、2638產(chǎn)孢量顯著減少；突變菌株952、995、1681、1980、2638孢子萌發(fā)率顯著下降；突變菌株952、994、1171、1250、1681在應(yīng)對NaCl鹽脅迫時與野生型響應(yīng)機制不同；突變菌株952、995在高滲透劑山梨醇脅迫下生長速率與野生型CH008存在明顯差異；952、1869、1980、2638在添加細(xì)胞壁抑制劑的培養(yǎng)基上抑制率顯著增大；菌株994、995、1250、1338、1869、1980、2638在金屬離子脅迫下響應(yīng)機制變化較大。(3)利用TAIL-PCR方法克隆各突變菌株插入位點的側(cè)翼序列,通過生物信息學(xué)方法對T-DNA插入位點進(jìn)行分析,對標(biāo)記基因進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果表明,菌株952 T-DNA插入位點位于起始外顯子區(qū)域,標(biāo)記基因CgDps編碼259個氨基酸,為DNA聚合酶α/δ/ε亞基；菌株994 T-DNA插入位點為基因末端外顯子附件區(qū)域,標(biāo)記基因CgAss編碼556個氨基酸,屬焦磷酸硫胺素家族,乙酰乳酸合成酶催化亞基；菌株995 T-DNA插入位點為基因轉(zhuǎn)錄起始位點附近區(qū)域,標(biāo)記基因CgCgt編碼444個氨基酸,為神經(jīng)酰胺糖基轉(zhuǎn)移酶；菌株1171 T-DNA插入位點為基因末端外顯子附近區(qū)域,標(biāo)記基因CgGgh編碼114個氨基酸,為糖苷酸水解酶基因；菌株1250標(biāo)記基因其中之一為CgGpp, T-DNA插入位點為基因末端外顯子附近區(qū)域,基因編碼314個氨基酸,為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體基因；菌株1338標(biāo)記基因CgHpI編碼155個氨基酸,為假定蛋白；菌株1681 T-DNA插入位點為起始外顯子附近區(qū)域,基因CgPss編碼682個氨基酸,為苯丙氨酰-tRNA合成酶p亞基；菌株1869 T-DNA插入位點位于轉(zhuǎn)錄起始位點啟動子區(qū)域,標(biāo)記基因CgPtr編碼418個氨基酸,為pH應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因；菌株2508標(biāo)記基因其中之一為CgHp2,T-DNA插入位點為居間外顯子區(qū)域,編碼313個氨基酸,為假定蛋白；菌株2638 T-DNA插入位點位于轉(zhuǎn)錄起始位點啟動子區(qū)域,標(biāo)記基因CgNsp編碼198個氨基酸,為NADP(H)結(jié)合蛋白(HSCARG).上述基因中,cgPtr與已知膠孢炭疽菌致病基因Pacl同源,其余9個基因的致病相關(guān)性,本文為首次報道,其中CgDps與CgNsp基因序列NCBI未能檢索獲得,為首次發(fā)現(xiàn)。(4)采用Split-marker方法對敲除載體進(jìn)行構(gòu)建,利用同源重組原理對柱花草炭疽菌突變菌株952和1869標(biāo)記基因CgDps,CgPtr進(jìn)行敲除,通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及PCR分子檢驗,最終獲得8株基因CgDps敲除突變體,5株基因CgPtr敲除突變體。對敲除突變體進(jìn)行致病力測定,結(jié)果表明,8株基因CgDps基因敲除突變體中,6株突變體致病力喪失,2株致病力減弱；在5株基因CgPtr敲除突變體中,3株突變體致病力喪失,2株致病力減弱。對敲除突變體進(jìn)行生物學(xué)性狀分析,結(jié)果表明,基因CgDps和CgPtr與菌落的生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)有關(guān),參與鹽脅迫響應(yīng)機制；基因CgDps、CgPtr可能具有誘導(dǎo)機體某種機制以應(yīng)對外界環(huán)境的金屬離子脅迫的作用；基因CgDps參與高滲透劑脅迫響應(yīng)機制；基因CgPtr具有誘導(dǎo)機體某種機制以應(yīng)對外界環(huán)境的pH變化的作用�；敬_定基因cgDps與CgPtr為致病相關(guān)基因,且CgDps為新的致病相關(guān)基因。
【關(guān)鍵詞】：柱花草 炭疽菌 致病缺陷突變體 致病相關(guān)基因 CgDps CgPtr
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11-22
• 1.1 柱花草11-12
• 1.2 柱花草炭疽病12-16
• 1.2.1 發(fā)生、分布與危害12
• 1.2.2 病原菌及生物學(xué)特性12-13
• 1.2.3 防治方法13-15
• 1.2.4 抗病機制及轉(zhuǎn)抗病基因的研究15-16
• 1.3 柱花草炭疽菌分子生物學(xué)研究16-20
• 1.3.1 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化16
• 1.3.2 T-DNA標(biāo)記基因側(cè)翼序列的研究16-17
• 1.3.3 基因敲除技術(shù)的研究17-19
• 1.3.4 膠孢炭疽菌致病相關(guān)基因的研究進(jìn)展19-20
• 1.4 研究內(nèi)容、目的及意義20-21
• 1.5 技術(shù)路線21-22
• 2 材料與方法22-39
• 2.1 試驗材料22-26
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒及植物材料22
• 2.1.2 試劑及抗生素22-24
• 2.1.3 儀器設(shè)備24
• 2.1.4 培養(yǎng)基24-25
• 2.1.5 引物25-26
• 2.2 試驗方法26-39
• 2.2.1 柱花草膠孢炭疽菌致病缺陷突變體的篩選26
• 2.2.2 致病缺陷突變體分子檢測26-30
• 2.2.3 致病缺陷突變體生物學(xué)性狀分析30-32
• 2.2.4 致病缺陷突變體T-DNA插入位點側(cè)翼序列的克隆與分析32-34
• 2.2.5 致病缺陷突變體952、1869 T-DNA標(biāo)記基因CgDps,CgPtr功能驗證34-39
• 3 結(jié)果與分析39-91
• 3.1 炭疽菌致病缺陷突變體的篩選39-40
• 3.2 炭疽菌致病缺陷突變體的分子檢測40-42
• 3.2.1 炭疽菌致病缺陷突變體T-DNA插入穩(wěn)定性PCR檢測40-41
• 3.2.2 炭疽菌致病缺陷突變體Southern印跡雜交驗證41-42
• 3.3 炭疽菌致病缺陷突變體生物學(xué)性狀分析42-56
• 3.3.1 致病缺陷突變體菌落形態(tài)及生長速率測定分析42-43
• 3.3.2 致病缺陷突變體產(chǎn)孢量及孢子形態(tài)分析43-45
• 3.3.3 致病缺陷突變體孢子萌發(fā)率的測定分析45-46
• 3.3.4 致病缺陷突變體NaCl鹽脅迫分析46-49
• 3.3.5 致病缺陷突變體高滲透劑山梨醇(Sorbitol)脅迫分析49-51
• 3.3.6 致病缺陷突變體細(xì)胞壁敏感性分析51-53
• 3.3.7 致病缺陷突變體金屬離子脅迫分析53-56
• 3.4 炭疽菌致病缺陷突變體T-DNA插入位點側(cè)翼序列的克隆與分析56-70
• 3.4.1 致病缺陷突變體T-DNA插入位點側(cè)翼序列的克隆56-57
• 3.4.2 致病缺陷突變體T-DNA插入位點標(biāo)記基因的預(yù)測57-70
• 3.5 致病缺陷突變體952、1869 T-DNA標(biāo)記基因CgDps、CgPtr功能驗證70-91
• 3.5.1 敲除突變體載體的構(gòu)建70-71
• 3.5.2 敲除突變體的獲得71-73
• 3.5.3 敲除突變體的分子檢測73-75
• 3.5.4 敲除突變體致病力的測定75-76
• 3.5.5 敲除突變體生物學(xué)性狀分析76-91
• 4 討論91-97
• 4.1 炭疽菌致病缺陷突變體的篩選91
• 4.2 炭疽菌致病缺陷突變體生物學(xué)性狀分析91-92
• 4.3 炭疽菌致病缺陷突變體T-DNA插入位點側(cè)翼序列的克隆92
• 4.4 炭疽菌致病缺陷突變體T-DNA插入位點標(biāo)記基因的分析92-95
• 4.5 基因CgDps、CgPtr功能驗證95-97
• 5 結(jié)論97-100
• 6 研究展望100-101
• 參考文獻(xiàn)101-114
• 基金項目資助114-115
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章115-117
• 致謝117

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 伍康榮;劉鳳民;張偉麗;陳梓健;許戴奇;黎志輝;羅喜梅;林國森;;茉莉酸甲酯和磷酸氫二鉀誘導(dǎo)柱花草對炭疽病的抗性[J];草業(yè)科學(xué);2015年07期

2 蔣國鳳;吳秋菊;韓路芬;姜伯樂;;假定蛋白基因XC2038與十字花科黑腐病菌致病相關(guān)[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2015年03期

3 扎西英派;張濤杰;霍生東;魏鎖成;阿依木古麗;;葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78研究進(jìn)展[J];西北民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年01期

4 劉鳳民;張偉麗;陳梓健;伍康榮;鐘李燕;黎卓航;;輻照柱花草M2代的農(nóng)藝性狀及分子水平的誘變效果分析[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年04期

5 鄭金龍;李秋潔;易克賢;習(xí)金根;高建明;張世清;陳河龍;賀春萍;吳偉懷;劉巧蓮;;9種殺菌劑對柱花草膠孢炭疽病菌的室內(nèi)毒力測定[J];熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年02期

6 劉曉晗;王峰;董愛榮;陳俏麗;劉立宏;零雅茗;王博文;丁曉霞;王世新;;粗毛纖孔菌糖苷水解酶5基因克隆及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析[J];林業(yè)科學(xué);2015年02期

7 劉艷;賀春萍;易克賢;習(xí)金根;吳偉懷;梁艷瓊;鄭金龍;李秋潔;鄭肖蘭;鄭服叢;;橡膠炭疽病菌致病相關(guān)突變體的篩選及表型分析[J];熱帶作物學(xué)報;2014年11期

8 張新怡;李雪;高兆銀;;熱帶亞熱帶水果膠孢炭疽菌對多菌靈的抗藥性測定[J];熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年11期

9 楊官品;林根妹;;新基因功能驗證技術(shù)及其在微藻基因克隆中的適用性分析[J];中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年10期

10 易克賢;鄭金龍;習(xí)金根;高建明;張世清;陳河龍;賀春萍;吳偉懷;;中國柱花草炭疽病病原菌遺傳多態(tài)性的AFLP分析[J];熱帶作物學(xué)報;2014年05期

  本文關(guān)鍵詞：柱花草膠孢炭疽菌致病缺陷突變體的篩選及其相關(guān)基因的克隆，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：438859