目的:在全世界范圍內(nèi),胃癌發(fā)病率占惡性腫瘤總發(fā)病率的第4位,而死亡率卻排在第3位的常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。我國(guó)是胃癌大國(guó),東南沿海地區(qū)是胃癌的高發(fā)地區(qū)。所以胃癌是嚴(yán)重影響我國(guó)國(guó)民健康的重大疾病。由于缺乏特異性癥狀,臨床上很難早期發(fā)現(xiàn),臨床Ⅲ期、Ⅳ期患者占大多數(shù)。目前胃癌內(nèi)科治療手段有限,能進(jìn)行根治性手術(shù)的患者比例小,化療療效欠佳,靶向治療也只有曲妥珠單抗和阿帕替尼取得了肯定的臨床療效,但適用人群有限,還存在著治療耐藥問(wèn)題。當(dāng)今腫瘤治療已進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代,需要找到新的治療靶點(diǎn),開(kāi)發(fā)新的治療藥物。ROS1是一種是單體型受體酪氨酸激酶,廣泛表達(dá)于人體腎、小腦、胃腸等多種組織。目前的研究發(fā)現(xiàn)在肺癌、卵巢癌、肉瘤、膽管細(xì)胞癌和炎性肌纖維母細(xì)胞瘤等組織中以基因重排方式激活,是一種癌基因。近年在非小細(xì)胞肺癌的臨床研究中找到了針對(duì)ROS1基因重排的治療藥物克唑替尼。使這一基因成為惡性腫瘤精準(zhǔn)治療研究的重要靶點(diǎn)。已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者在胃癌臨床組織標(biāo)本中用FISH方法檢測(cè)到ROS1基因重排,且確定ROS1基因重排與差的臨床表型如低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此雖然ROS1基因重排在胃癌中檢出率不高,但已經(jīng)開(kāi)發(fā)出確定有效的...

【文章頁(yè)數(shù)】：135 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語(yǔ)
第一部分 :ROS1基因穩(wěn)定沉默胃癌細(xì)胞株的建立
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
            2.1.2 質(zhì)粒
            2.1.3 PCR引物
            2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            2.1.5 主要實(shí)驗(yàn)試劑
            2.1.6 主要溶液的配置
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 胃癌細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.3 ROS1 基因穩(wěn)定沉默胃癌細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)
            2.2.4 Western blot鑒定胃癌細(xì)胞ROS1 蛋白的表達(dá)
            2.2.5 Real-time PCR方法鑒定ROS1 基因敲減效率
        2.3 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 ROS1 基因在胃癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)
        3.2 成功建立ROS1 基因穩(wěn)定沉默的胃癌細(xì)胞株
            3.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及測(cè)序驗(yàn)證
            3.2.2 ROS1 基因穩(wěn)定沉默胃癌細(xì)胞株的建立
        3.3 ROS1 基因敲減效率測(cè)定
            3.3.1 應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)ROS1 基因敲減后胃癌細(xì)胞ROS1 mRNA表達(dá)減低
            3.3.2 應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)ROS1 基因敲減后胃癌細(xì)胞ROS1 蛋白表達(dá)降低
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分 :ROS1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 胃癌細(xì)胞
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 主要試劑
            2.1.4 主要溶液配制
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 MTT法測(cè)定各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
            2.2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞成瘤能力
            2.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
            2.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
            2.2.5 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移能力
            2.2.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察胃癌細(xì)胞侵襲能力
        2.3 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 ROS1 基因沉默后胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢
        3.2 ROS1 基因沉默后胃癌細(xì)胞克隆形成數(shù)量減少
        3.3 ROS1 基因沉默后細(xì)胞周期G1 期比例升高,S/G2 期比例下降
        3.4 ROS1 基因沉默后胃癌細(xì)胞凋亡比例增高
        3.5 ROS1 基因沉默后胃癌細(xì)胞劃痕愈合率減慢
        3.6 ROS1 基因沉默后胃癌細(xì)胞穿過(guò)小室微孔膜數(shù)量減少
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分 :ROS1基因影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 胃癌細(xì)胞株
            2.1.2 PCR引物
            2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            2.1.4 主要試劑
            2.1.5 主要溶液配制
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 Western blot方法檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白
            2.2.2 Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞粘附蛋白及細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)
            2.2.3 Western blot方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白表達(dá)
            2.2.4 Real-time PCR方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子
            2.2.5 Real-time PCR方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP9 表達(dá)情況
        2.3 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果
        3.1 ROS1 基因沉默后胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子變化
        3.2 ROS1 基因沉默后細(xì)胞粘附蛋白及細(xì)胞骨架蛋白的變化
        3.3 ROS1 基因沉默后胃癌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白變化
        3.4 ROS1 基因沉默后胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist,Snail,Slug表達(dá)下降
        3.5 ROS1 基因沉默后胃癌細(xì)胞MMP9 基因表達(dá)下降
    4 討論
    5 結(jié)論
第四部分 :ROS1在胃癌組織中過(guò)表達(dá)且與胃癌不良預(yù)后相關(guān)
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌組織中ROS1 mRNA的表達(dá)與臨床病理因素及患者預(yù)后的關(guān)系以及ROS1 基因擴(kuò)增情況
            2.1.2 組織標(biāo)本
            2.1.3 主要儀器
            2.1.4 主要試劑
            2.1.5 主要試劑溶液配置
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 qRT-PCR法檢測(cè)ROS1 mRNA在37 例胃癌及其配對(duì)正常胃粘膜組織中的表達(dá)
            2.2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胃癌組織中ROS1 蛋白表達(dá)
    3 結(jié)果
        3.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)ROS1 mRNA在胃癌組織中高表達(dá)
        3.2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)ROS1 mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系及意義
        3.3 ROS1 mRNA表達(dá)與胃癌總生存率的關(guān)系
        3.4 TCGA數(shù)據(jù)中ROS1 基因擴(kuò)增
        3.5 qRT-PCR方法檢測(cè)ROS1 mRNA在37 例胃癌組織中高表達(dá)
        3.6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ROS1 蛋白在胃癌及正常胃粘膜組織中的表達(dá)
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：4044798