目的利用常間回文重復(fù)序列叢集(CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(Cas9)系統(tǒng)敲除小鼠腎內(nèi)髓集合管3(m-IMCD3)上皮細(xì)胞的水通道蛋白2(Aqp2)基因。方法1.在小鼠Aqp2基因的第1、4個(gè)外顯子上各設(shè)計(jì)兩個(gè)小向?qū)NA(sgRNA),分別為sgRNA1-1、sgRNA1-2、sgRNA4-1、sgRNA4-2,并將其成功克隆進(jìn)lentiCRISPR V2載體上。2.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到m-IMCD3細(xì)胞中。3.用含5μg/ml的嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選細(xì)胞,直至對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后,換成含1μg/ml的嘌呤霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。4.提取各單克隆細(xì)胞系的基因組DNA。5.以提取的單克隆細(xì)胞系的基因組為模板,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出sgRNA作用靶點(diǎn)的DNA片段并測(cè)序。6.設(shè)計(jì)Aqp2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物,利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Aqp2 mRNA的表達(dá)。7.利用免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞系A(chǔ)qp2的表達(dá)。結(jié)果1.成功構(gòu)建出含有相應(yīng)sgRNA的載體;2.成...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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結(jié)果
討論
結(jié)論
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本文編號(hào)：4031707