目的:利用CRISPR/Cas9技術(shù)簡單高效地激活內(nèi)源性基因表達(dá)的研究。方法:通過合成的sgRNA表達(dá)盒去指導(dǎo)一個包含轉(zhuǎn)錄激活因子(VP64,p65和Rta)并且無核酸酶的Cas9復(fù)合物,從而進(jìn)行位點特異性誘導(dǎo)內(nèi)源性基因的表達(dá)。我們設(shè)計了SpCas9 sgRNA表達(dá)盒與SaCas9 sgRNA表達(dá)盒,通過誘導(dǎo)人和大鼠細(xì)胞中的多個基因,測試兩種CRISPR激活系統(tǒng)(dSpCas9-VPR,dSaCas9-VPR)。我們通過pmaxGFP轉(zhuǎn)染法檢測不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,使用CRISPR/Cas9激活劑進(jìn)行基因激活,應(yīng)用qPCR比較目的基因的相對表達(dá)量,用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測被轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的基因表達(dá)。結(jié)果:兩種CRISPR/Cas9均可在人體細(xì)胞中有效誘導(dǎo)激活六種不同的神經(jīng)發(fā)育基因(CRX,RORB,RAX,OTX2,ASCL1和NEUROD1),而在大鼠細(xì)胞誘導(dǎo)激活三種不同基因(Ascl1,Neurod1和Nrl)表現(xiàn)出更多不確定性以及低效的基因誘導(dǎo)水平。結(jié)論:本研究提供了一種簡單地使用CRISPR/Cas9激活劑有效激活內(nèi)源性基因表達(dá)的方法,該方法能優(yōu)化實驗室工作流程,有助于推動分子細(xì)胞生物...

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的背景介紹
    1.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)基本原理
        1.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作流程
        1.2.2 sg RNA與CRISPR/Cas9的相互作用
        1.2.3 Cas9的常用類型概述
    1.3 d Cas9激活系統(tǒng)概述
        1.3.1 d Cas9-VPR
        1.3.2 d Cas9-SAM
        1.3.3 d Cas9-Sun Tag
    1.4 CRISPR/Cas9在視網(wǎng)膜疾病的應(yīng)用
        1.4.1 CRISPR/Cas9在視網(wǎng)膜疾病模型的應(yīng)用
        1.4.2 CRISPR/Cas9對視網(wǎng)膜疾病的基因治療
    1.5 CRISPR/Cas9與細(xì)胞直接重編程
    1.6 本實驗研究的目的與意義
第二章
    引言
    材料與方法
        2.1 主要實驗器材和試劑
        2.2 sg RNA設(shè)計與表達(dá)盒的制備
            2.2.1 Sp Cas9、Sa Cas9和sg RNA表達(dá)盒的設(shè)計
            2.2.2 PCR擴(kuò)增sg RNA表達(dá)盒
            2.2.3 凝膠電泳
            2.2.4 提取sg RNA表達(dá)盒
        2.3 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.3.1 溶液配制
            2.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇
            2.3.3 細(xì)胞維持
            2.3.4 細(xì)胞傳代
            2.3.5 細(xì)胞凍存
        2.4 轉(zhuǎn)染效率分析
        2.5 使用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因激活
        2.6 q PCR分析
            2.6.1 RNA的提取
            2.6.2 c DNA的合成
            2.6.3 基因表達(dá)測定
        2.7 免疫細(xì)胞化學(xué)分析
            2.7.1 溶液配制
            2.7.2 免疫染色
        2.8 數(shù)據(jù)分析
第三章 結(jié)果
    3.1 在人體細(xì)胞中測試d Sp Cas9-VPR系統(tǒng)
    3.2 在鼠類細(xì)胞中測試d Sp Cas9-VPR系統(tǒng)
    3.3 在人體細(xì)胞中測試d Sa Cas9-VPR系統(tǒng)
    3.4 在大鼠細(xì)胞中測試d Sa Cas9-VPR系統(tǒng)
第四章 討論
第五章 結(jié)論
第六章 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
索引
在校期間發(fā)表論文及科研成果
致謝



本文編號：4019283