目的:利用CRISPR/Cas9技術簡單高效地激活內源性基因表達的研究。方法:通過合成的sgRNA表達盒去指導一個包含轉錄激活因子(VP64,p65和Rta)并且無核酸酶的Cas9復合物,從而進行位點特異性誘導內源性基因的表達。我們設計了SpCas9 sgRNA表達盒與SaCas9 sgRNA表達盒,通過誘導人和大鼠細胞中的多個基因,測試兩種CRISPR激活系統(tǒng)(dSpCas9-VPR,dSaCas9-VPR)。我們通過pmaxGFP轉染法檢測不同細胞的轉染效率,使用CRISPR/Cas9激活劑進行基因激活,應用qPCR比較目的基因的相對表達量,用免疫細胞化學方法檢測被轉錄因子誘導的基因表達。結果:兩種CRISPR/Cas9均可在人體細胞中有效誘導激活六種不同的神經(jīng)發(fā)育基因(CRX,RORB,RAX,OTX2,ASCL1和NEUROD1),而在大鼠細胞誘導激活三種不同基因(Ascl1,Neurod1和Nrl)表現(xiàn)出更多不確定性以及低效的基因誘導水平。結論:本研究提供了一種簡單地使用CRISPR/Cas9激活劑有效激活內源性基因表達的方法,該方法能優(yōu)化實驗室工作流程,有助于推動分子細胞生物...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的背景介紹
    1.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術基本原理
        1.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作流程
        1.2.2 sg RNA與CRISPR/Cas9的相互作用
        1.2.3 Cas9的常用類型概述
    1.3 d Cas9激活系統(tǒng)概述
        1.3.1 d Cas9-VPR
        1.3.2 d Cas9-SAM
        1.3.3 d Cas9-Sun Tag
    1.4 CRISPR/Cas9在視網(wǎng)膜疾病的應用
        1.4.1 CRISPR/Cas9在視網(wǎng)膜疾病模型的應用
        1.4.2 CRISPR/Cas9對視網(wǎng)膜疾病的基因治療
    1.5 CRISPR/Cas9與細胞直接重編程
    1.6 本實驗研究的目的與意義
第二章
    引言
    材料與方法
        2.1 主要實驗器材和試劑
        2.2 sg RNA設計與表達盒的制備
            2.2.1 Sp Cas9、Sa Cas9和sg RNA表達盒的設計
            2.2.2 PCR擴增sg RNA表達盒
            2.2.3 凝膠電泳
            2.2.4 提取sg RNA表達盒
        2.3 細胞培養(yǎng)
            2.3.1 溶液配制
            2.3.2 細胞復蘇
            2.3.3 細胞維持
            2.3.4 細胞傳代
            2.3.5 細胞凍存
        2.4 轉染效率分析
        2.5 使用CRISPR/Cas9進行基因激活
        2.6 q PCR分析
            2.6.1 RNA的提取
            2.6.2 c DNA的合成
            2.6.3 基因表達測定
        2.7 免疫細胞化學分析
            2.7.1 溶液配制
            2.7.2 免疫染色
        2.8 數(shù)據(jù)分析
第三章 結果
    3.1 在人體細胞中測試d Sp Cas9-VPR系統(tǒng)
    3.2 在鼠類細胞中測試d Sp Cas9-VPR系統(tǒng)
    3.3 在人體細胞中測試d Sa Cas9-VPR系統(tǒng)
    3.4 在大鼠細胞中測試d Sa Cas9-VPR系統(tǒng)
第四章 討論
第五章 結論
第六章 展望
參考文獻
附錄
索引
在校期間發(fā)表論文及科研成果
致謝



本文編號：4019283