Micro RNA（mi RNA）是一類大小約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性短非編碼RNA,廣泛存在于動植物體內(nèi),通常結(jié)合機(jī)體內(nèi)靶m RNA 3’非編碼區(qū)（3’UTR）從而抑制m RNA的翻譯進(jìn)而對基因表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。根據(jù)mi RNA在基因組上與其它轉(zhuǎn)錄單位的位置關(guān)系,mi RNA可分為基因間mi RNA（intergenic mi RNAs）和基因內(nèi)mi RNA（intragenic mi RNA）,而后者包括蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子或內(nèi)含子mi RNA。目前,盡管在動物和植物中對mi RNA功能研究已經(jīng)揭示的很清楚了,但對mi RNA基因自身的轉(zhuǎn)錄了解仍十分有限,而對位于基因內(nèi)的mi RNA及其與宿主基因的轉(zhuǎn)錄關(guān)系,更是知之甚少。本實(shí)驗(yàn)室前期對mi R-135a在脂肪生成的作用和功能進(jìn)行了探索研究,但mi R-135a在脂肪生成過程中的本身轉(zhuǎn)錄機(jī)制并不清楚。因此,本研究采用生物信息學(xué)預(yù)測、啟動子雙熒光素酶報(bào)告基因載體、點(diǎn)突變、EMSA、Ch IP、Ch IP-q PCR、q-PCR和western blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)對mi R-135a-1/2的轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下:1.mi...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文縮寫對照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 引言
    2 miRNA的發(fā)現(xiàn)及特征
        2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
        2.2 miRNA的特征
    3 miRNA在基因組上的位置
    4 miRNA的生物合成及作用機(jī)制
    5 miRNA家族
    6 調(diào)控脂肪生成的重要轉(zhuǎn)錄因子
    7 STAT5
    8 miR-135的研究綜述
    9 選題的目的和意義
第二章 材料與方法
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 DNA樣品
        1.2 載體與菌株
        1.3 主要試劑和儀器
        1.4 主要試劑配制
        1.5 主要數(shù)據(jù)庫及分析軟件
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 啟動子預(yù)測及其雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建
            2.1.1 miRNA啟動子區(qū)域的預(yù)測
            2.1.2 預(yù)測的啟動子雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
            2.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇
            2.2.2 細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)
            2.2.3 細(xì)胞凍存
            2.2.4 3T3-L1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
            2.2.5 細(xì)胞基因組DNA、總RNA及總蛋白的提取
        2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性的測定
            2.3.1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
            2.3.2 雙熒光素酶相對活性的檢測
        2.4 預(yù)測核心啟動子片段中轉(zhuǎn)錄因子和突變載體的構(gòu)建及熒光素酶活性檢測
            2.4.1 預(yù)測核心啟動子片段中轉(zhuǎn)錄因子
            2.4.2 核心轉(zhuǎn)錄因子STAT5a雙熒光素酶突變載體的構(gòu)建及熒光活性檢測23
        2.5 EMSA和Ch IP驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子STAT5a在細(xì)胞體外體內(nèi)與miR-135a-1/2 啟動子結(jié)合
            2.5.1 EMSA驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子STAT5a在細(xì)胞體外與miR-135a-1/2 啟動子結(jié)合
            2.5.2 Ch IP驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子STAT5a在細(xì)胞體內(nèi)與miR-135a-1/2 啟動子結(jié)合
        2.6 超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.7 Q-PCR分析
            2.7.1 miRNA的定量分析
            2.7.2 基因的定量分析
            2.7.3 Ch IP-qPCR
        2.8 油紅O染色
        2.9 Western blotting分析
            2.9.1 蛋白濃度測定
            2.9.2 SDS-PAGE電泳
            2.9.3 轉(zhuǎn)膜
            2.9.4 抗原抗體免疫反應(yīng)
            2.9.5 抗體
        2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第三章 結(jié)果與分析
    1 miR-135a-1 和miR-135a-2 分別在其宿主基因上的位置
    2 miR-135a-1 啟動子區(qū)域及調(diào)節(jié)元件鑒定
        2.1 網(wǎng)站預(yù)測miR-135a-1 啟動子區(qū)域
        2.2 miR-135a-1 啟動子區(qū)域分段載體的構(gòu)建及雙熒光活性分析
        2.3 miR-135a-1 核心轉(zhuǎn)錄因子的鑒定
    3 miR-135a-2 啟動子區(qū)域及調(diào)節(jié)元件鑒定
        3.1 網(wǎng)站預(yù)測miR-135a-2 啟動子區(qū)域
        3.2 miR-135a-2 啟動子區(qū)域分段載體的構(gòu)建及雙熒光素酶活性分析
        3.3 STAT5a同樣結(jié)合在miR-135a-2 的核心啟動子區(qū)域
        3.4 EMSA和Ch IP驗(yàn)證STAT5a在細(xì)胞體外體內(nèi)結(jié)合miR-135a-1/2 啟動子
    4 STAT5a上調(diào)miR-135a的表達(dá)
    5 STAT5a與APC之間存在著潛在的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路
第四章 討論
結(jié)語
    1 研究結(jié)論
    2 創(chuàng)新性
    3 研究的不足之處
參考文獻(xiàn)
附錄
研究生在讀期間發(fā)表的主要論文
致謝



本文編號：4019158