3-磷酸甘油�；D(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases, GPAT)是催化植物甘油脂從頭合成第1步酰化反應(yīng)的限速酶。分離和鑒定甘藍(lán)型油菜(Brasscia napus)的GPAT編碼基因?qū)⒂兄谏钊虢馕龇N子中甘油脂的合成代謝機(jī)制。本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)擴(kuò)增獲得13個(gè)甘藍(lán)型油菜中具有�；D(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域的候選編碼基因,構(gòu)建至酵母(Saccharomyces cerevisiae)異源表達(dá)載體y ADH1-p YES2-Kan V2 (外源基因表達(dá)受葡萄糖誘導(dǎo),受半乳糖抑制)。重組酵母表達(dá)載體酶切和測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示,克隆的13個(gè)基因片段大小和序列與預(yù)期相符;通過氨基酸序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)克隆基因編碼的氨基酸序列分別含有1～2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和4個(gè)�；D(zhuǎn)移酶保守序列。進(jìn)一步利用本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的高效條件致死型酵母雙敲除突變體菌株ZAFU1篩選體系(BY4742, gat1Δgat2Δ+[pGAL1::At GPAT1 LEU2])進(jìn)行遺傳互補(bǔ)驗(yàn)證,結(jié)果顯示,在葡萄糖誘導(dǎo)條件下,BnGPA...

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圖1酵母表達(dá)載體pYES2-yADH1-KanV2簡(jiǎn)要結(jié)構(gòu)

酵母(S.cerevisiae)菌株ZAFU1(BY4742,gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT1LEU2])感受態(tài)細(xì)胞制備參照本實(shí)驗(yàn)室Lei等(2018)的方法。重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化3μg，轉(zhuǎn)化液分別涂布于SC-Ura-His-Leu+Glucose和S....

圖2BnGPAT家族成員的氨基酸序列比對(duì)

進(jìn)一步從半乳糖培養(yǎng)基中挑取各外源基因轉(zhuǎn)化的單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)濃度梯度稀釋實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)BnGPAT1-1和BnGPAT9-1具有類似酵母�；D(zhuǎn)移酶編碼基因YKR067w(GAT1)的功能(Zhengetal.,2001)。結(jié)果顯示，BnGPAT4-1和BnGPAT4-2基因....

圖3BnGPATs重組酵母表達(dá)載體雙酶切鑒定

圖2BnGPAT家族成員的氨基酸序列比對(duì)圖4部分異源表達(dá)BnGPATs基因在條件型致死酵母雙突變體菌株ZAFU1中的功能遺傳互補(bǔ)

圖4部分異源表達(dá)BnGPATs基因在條件型致死酵母雙突變體菌株ZAFU1中的功能遺傳互補(bǔ)

圖3BnGPATs重組酵母表達(dá)載體雙酶切鑒定2.4酵母外源目的基因驗(yàn)證

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