本文關(guān)鍵詞：結(jié)縷草中鹽脅迫響應(yīng)基因的克隆與功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：我國鹽堿土地面積大,分布廣,水資源短缺,水污染嚴(yán)重,因此需要提高植物的抗旱耐鹽堿能力來適應(yīng)我國水資源缺乏以及鹽堿土面積大分布廣的現(xiàn)狀。結(jié)縷草是一種被廣泛應(yīng)用的抗旱耐鹽堿能力強(qiáng)的暖季型草坪草,因此,本研究從結(jié)縷草鹽脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫里篩選和克隆響應(yīng)鹽脅迫的基因進(jìn)行研究,希望對(duì)提高植物耐鹽性提供一定的理論基礎(chǔ),同時(shí)為通過生物技術(shù)提高植物耐鹽堿能力提供候選基因。在本研究中,通過RT-PCR和qRT-PCR技術(shù),從結(jié)縷草鹽脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫里被注釋為ERF類的unigenes里篩選得到4個(gè)基因,然后以結(jié)縷草cDNA為模板,通過RACE技術(shù)克隆獲得了3個(gè)基因(ZjRAP2-11、ZjERF7和ZjERF10)的全長cDNA;此外,通過與其他物種同源基因的比對(duì)和驗(yàn)證,克隆得到了結(jié)縷草ZjCCS基因的完整ORF框序列。最后,分別對(duì)這4個(gè)基因進(jìn)行研究,4個(gè)基因的研究結(jié)果如下：通過RACE技術(shù)獲得ZjERF10的全長cDNA 767 bp,其中,5'UTR 117 bp,3' UTR 215 bp, ORF長435 bp,編碼145個(gè)氨基酸,blastp比對(duì)沒有檢測到保守的結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該基因是一個(gè)非核定位的基因。生物信息學(xué)分析顯示：該蛋白為不穩(wěn)定的親水性脂溶蛋白,具有跨膜區(qū)段,但不具有信號(hào)肽。qRT-PCR結(jié)果顯示：在鹽處理4 h之內(nèi)該基因在葉片與根系中均表達(dá)上調(diào),但表達(dá)模式不同,該基因不僅受到鹽脅迫的誘導(dǎo),對(duì)于ABA、乙烯等其他非生物脅迫也會(huì)響應(yīng)表達(dá)上調(diào)。該基因過表達(dá)轉(zhuǎn)入禾本科模式植物水稻,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)嚴(yán)重?cái)∮�、結(jié)實(shí)率顯著下降的表型;在浸種相同時(shí)間的條件下, T0代種子萌發(fā)早于野生型；培養(yǎng)相同時(shí)間,轉(zhuǎn)基因植株的T1代幼苗地上部分和地下部分均矮于野生型；在250 mM·L-1 NaCl處理5 h條件下,T1代轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性強(qiáng)于野生型。因此,推測該基因可能是一個(gè)編碼離子通道類蛋白的基因,在植物生長發(fā)育過程中起副調(diào)控作用,在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中起正調(diào)控作用。通過RACE技術(shù)克隆得到ZjRAP2-11基因的全長cDNA 1269 bp,其中5’UTR 92bp,3'UTR 262 bp, ORF長915 bp,編碼305個(gè)氨基酸,具有AP2超家族的保守結(jié)構(gòu)域,與谷子、玉米、水稻等其他物種中預(yù)測的響應(yīng)乙烯的轉(zhuǎn)錄因子RAP2-11-like相似度很高,亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該基因定位于細(xì)胞核中；RACE技術(shù)克隆得到結(jié)縷草ZjERF7基因的全長cDNA 577 bp,其中5'UTR 157 bp,3'UTR 159 bp,ORF長261 bp,編碼87個(gè)氨基酸,在NCBI中沒有檢測到保守結(jié)構(gòu)域,NCBI數(shù)據(jù)庫中只有2個(gè)基因的氨基酸序列可以與之比對(duì)上,但是相似度不高,只有33%,亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該基因在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均存在。生物信息學(xué)分析結(jié)果推測ZjAP2-11基因編碼的蛋白為不穩(wěn)定的親水性脂溶蛋白,不具有跨膜區(qū)段；2jERF7基因編碼的蛋白為不穩(wěn)定的親水性脂溶蛋白,具有跨膜區(qū)段。qRT-PCR結(jié)果顯示,ZjRAP2-11和ZjERF7在ABA、乙烯、Air Dry和Cool 4種非生物脅迫均會(huì)表達(dá)上調(diào),但是,在AirDry脅迫下,ZjRAP2-11的表達(dá)量上升不明顯,同時(shí),根系和葉片中的ZjRAP2-11和ZjERF7對(duì)于鹽脅迫均會(huì)做出響應(yīng)表達(dá)上調(diào),但是表達(dá)模式不同,因此認(rèn)為ZjRAP2-11和ZjERF7基因在結(jié)縷草響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮作用。為了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侶基因(CCS)在結(jié)縷草非生物脅迫過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,以結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為依據(jù),結(jié)縷草cDNA為模板,通過RT-PCR技術(shù),克隆了924 bp結(jié)縷草ZjCCS核酸序列,編碼一個(gè)含有307個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析顯示：該蛋白穩(wěn)定的疏水性脂溶蛋白,具有跨膜區(qū)段；與小米、玉米、甘蔗和水稻具有較高的同源性,含有植物CCS蛋白所特有的3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR結(jié)果顯示,在鹽脅迫條件下,ZjCCS基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在4 h表達(dá)量達(dá)到最大值,相對(duì)于鹽脅迫,干旱脅迫和重金屬脅迫對(duì)ZjCCS基因的表達(dá)量影響不大,推測ZjCCS基因在結(jié)縷草響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)縷草 基因克隆 生物信息學(xué)分析 非生物脅迫 轉(zhuǎn)基因
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S688.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 1. 引言10-18
• 1.1. 研究背景10-16
• 1.1.1. 土壤鹽堿化的危害10
• 1.1.2. 植物對(duì)鹽脅迫的感受機(jī)制10-11
• 1.1.3. 根系中響應(yīng)鹽脅迫的基因調(diào)控11-12
• 1.1.4. Na~+和K~+的運(yùn)輸網(wǎng)絡(luò)12-13
• 1.1.5. NHX和SOS在維持細(xì)胞質(zhì)中低Na~+的作用13-14
• 1.1.6. HKT是植物耐鹽和Na~+由根系向上運(yùn)輸?shù)闹饕獏⑴c者14-16
• 1.1.7. 結(jié)縷草基因的研究進(jìn)展16
• 1.2. 研究的目的與意義16-17
• 1.3. 研究內(nèi)容與技術(shù)路線17-18
• 2. 結(jié)縷草鹽脅迫響應(yīng)基因的克隆與篩選18-34
• 2.1. 材料與方法18-28
• 2.1.1. 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 2.1.2. 實(shí)驗(yàn)方法20-28
• 2.2. 結(jié)果與分析28-32
• 2.2.1. PCR擴(kuò)增28-29
• 2.2.2. qRT-PCR驗(yàn)證29-30
• 2.2.3. RACE全長克隆30-32
• 2.3. 討論與結(jié)論32-34
• 3. 結(jié)縷草ZjERF10基因的克隆與功能研究34-56
• 3.1. 材料與方法34-41
• 3.1.1. 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 3.1.2. 試驗(yàn)方法35-41
• 3.2. 結(jié)果與分析41-53
• 3.2.1. 結(jié)縷草ZjERF10基因的RACE克隆41-42
• 3.2.2. 結(jié)縷草ZjERF10基因預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征分析42-43
• 3.2.3. 結(jié)縷草ZjERF10基因的亞細(xì)胞定位43
• 3.2.4. 結(jié)縷草ZjERF10基因過表達(dá)載體的構(gòu)建與水稻遺傳轉(zhuǎn)化43-46
• 3.2.5. 結(jié)縷草ZjERF10基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)46-48
• 3.2.6. 結(jié)縷草ZjERF10基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的表型及功能觀察48-53
• 3.3. 討論與結(jié)論53-56
• 4. 結(jié)縷草ZjERF1基因的克隆與表達(dá)分析56-66
• 4.1. 材料與方法56
• 4.1.1. 實(shí)驗(yàn)材料56
• 4.1.2. 試驗(yàn)方法56
• 4.2. 結(jié)果與分析56-64
• 4.2.1. 結(jié)縷草ZjERF1基因的RACE克隆56-58
• 4.2.2. 結(jié)縷草ZjERF1基因預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征分析58
• 4.2.3.結(jié)縷草ZjRAP2/11/基因氨基酸序列的同源性比對(duì)和進(jìn)化樹分析58-60
• 4.2.4. 結(jié)縷草ZjERF1基因的亞細(xì)胞定位60-61
• 4.2.5. 結(jié)縷草ZjERF1對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)61-64
• 4.3. 討論與結(jié)論64-66
• 5. 結(jié)縷草ZjERF7基因的克隆與表達(dá)分析66-74
• 5.1. 材料與方法66
• 5.1.1. 實(shí)驗(yàn)材料66
• 5.1.2. 試驗(yàn)方法66
• 5.2. 結(jié)果與分析66-72
• 5.2.1. 結(jié)縷草ZjERF7基因的RACE克隆66-67
• 5.2.2. 結(jié)縷草ZjERF7基因預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征分析67-68
• 5.2.3. 結(jié)縷草ZjERF7基因的亞細(xì)胞定位68-69
• 5.2.4. 結(jié)縷草ZjERF7基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)69-72
• 5.3. 討論與結(jié)論72-74
• 6. 結(jié)縷草ZjCCS基因的克隆與表達(dá)分析74-86
• 6.1. 材料與方法74-75
• 6.1.1. 實(shí)驗(yàn)材料74
• 6.1.2. 實(shí)驗(yàn)方法74-75
• 6.2. 結(jié)果與分析75-83
• 6.2.1. 結(jié)縷草ZjCCS基因的克隆75-78
• 6.2.2. 結(jié)縷草ZjCCS蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征分析78
• 6.2.3. 結(jié)縷草ZjCCS基因氨基酸序列的同源性和進(jìn)化樹分析78-82
• 6.2.4. 結(jié)縷草ZjCCS基因表達(dá)分析82-83
• 6.3. 討論與結(jié)論83-86
• 6.3.1. ZjCCS蛋白功能預(yù)測83-85
• 6.3.2. 鹽、干旱和重金屬脅迫下結(jié)縷草ZjCCS基因的差異表達(dá)85-86
• 7. 結(jié)論與展望86-88
• 7.1. 全文總結(jié)86
• 7.2. 研究展望86-88
• 參考文獻(xiàn)88-98
• 個(gè)人簡介98-100
• 導(dǎo)師簡介100-102
• 獲得成果目錄102-104
• 致謝104

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王艷;結(jié)縷草研究進(jìn)展[J];中國草地;2003年02期

2 郭海林,劉建秀;結(jié)縷草屬植物育種進(jìn)展概述[J];草業(yè)學(xué)報(bào);2004年03期

3 賀杰;孫振元;魏建華;王宏芝;校現(xiàn)周;李瑞芬;;結(jié)縷草生物技術(shù)研究進(jìn)展[J];武漢植物學(xué)研究;2006年01期

4 李圓圓;;重慶地區(qū)結(jié)縷草屬的草坪草[J];西南園藝;2006年01期

5 王文強(qiáng);李志丹;白昌軍;;結(jié)縷草屬種質(zhì)資源及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];草原與草坪;2006年02期

6 楊麗娟;;生物技術(shù)在結(jié)縷草屬研究中的應(yīng)用[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(bào);2007年22期

7 陳瑩;何八斤;周禾;張劍岷;;結(jié)縷草屬種質(zhì)資源評(píng)述[J];草業(yè)科學(xué);2008年01期

8 董令善;田有鳳;;膠州市結(jié)縷草資源及其開發(fā)利用的探討[J];中國草地;1992年01期

9 茍文龍,張新全,白史且,石振田;溝葉結(jié)縷草研究進(jìn)展[J];草業(yè)科學(xué);2002年03期

10 李亞,劉建秀,向其伯;結(jié)縷草屬種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J];草業(yè)學(xué)報(bào);2002年02期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄒伯琴;施桂芬;李彥;賀永寰;朱有平;;青島膠州灣地區(qū)結(jié)縷草種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用[A];中國草地科學(xué)進(jìn)展：第四屆第二次年會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)文集[C];1996年

2 秦杰;朱雪芬;孫明;;上海結(jié)縷草在開放式公共綠地中的應(yīng)用及養(yǎng)護(hù)關(guān)鍵技術(shù)[A];中國草學(xué)會(huì)草坪專業(yè)委員會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2010年

3 郭海林;劉建秀;朱雪花;宣繼萍;;結(jié)縷草屬植物雜交育種及其雜種鑒定Ⅱ——同工酶的變異分析[A];中國草學(xué)會(huì)草坪專業(yè)委員會(huì)第六屆全國會(huì)員代表大會(huì)及第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2004年

4 翁仁憲;;臺(tái)灣結(jié)縷草的種原特性及育種[A];草坪與地被科學(xué)進(jìn)展論文匯編[C];2006年

5 才宏偉;井上真以子;湯山奈奈;;結(jié)縷草分子標(biāo)記的開發(fā)與遺傳圖譜的構(gòu)建[A];中國草學(xué)會(huì)牧草育種專業(yè)委員會(huì)2007年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

6 宣繼萍;宋玉峰;郭忠仁;劉建秀;;結(jié)縷草低溫脅迫后的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[A];第六屆中國植物逆境生理學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

7 郭海林;高雅丹;薛丹丹;陳宣;劉建秀;;結(jié)縷草屬植物抗寒性的遺傳分析[A];中國植物學(xué)會(huì)七十五周年年會(huì)論文摘要匯編（1933-2008）[C];2008年

8 宣繼萍;周志芳;劉建秀;程曉麗;;結(jié)縷草冷馴化可溶性蛋白研究[A];中國草學(xué)會(huì)牧草育種專業(yè)委員會(huì)2007年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

9 郭海林;朱雪花;劉建秀;郭愛桂;宣繼萍;;結(jié)縷草屬植物雜交育種及其雜種鑒定Ⅰ——外部性狀的變異分析[A];中國草學(xué)會(huì)草坪專業(yè)委員會(huì)第六屆全國會(huì)員代表大會(huì)及第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2004年

10 宣繼萍;宋玉峰;張紅曉;郭忠仁;;冷脅迫下兩個(gè)結(jié)縷草品種的匍匐莖蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析[A];中國園藝學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2012年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 孫潔峰　董令善;結(jié)縷草產(chǎn)業(yè)發(fā)展廿年[N];中國花卉報(bào);2004年

2 譚志堅(jiān)　譚繼清　徐禮根 　　;美國結(jié)縷草品種來源及應(yīng)用區(qū)域（一）[N];中國花卉報(bào);2004年

3 程霞;結(jié)縷草[N];中國花卉報(bào);2003年

4 方海;遼大結(jié)縷草研究成果豐碩[N];市場報(bào);2000年

5 張靈丁;讓結(jié)縷草常綠[N];市場報(bào);2000年

6 重慶園林科研所 譚繼清 譚志堅(jiān) 重慶市體育場 周福生;我國足球場草坪問題探討[N];中國花卉報(bào);2003年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 馬春暉;結(jié)縷草繁殖特性及其種子生產(chǎn)技術(shù)的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

2 黃錦文;結(jié)縷草溫度脅迫的生理響應(yīng)及其分子機(jī)制研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

3 金洪;中國結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）遺傳多樣性研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2004年

4 張學(xué)勇;遼東半島結(jié)縷草種群動(dòng)態(tài)及其生活史格局研究[D];東北師范大學(xué);2012年

5 王艷;結(jié)縷草種群生態(tài)的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2001年

6 王繼朋;硅在幾種植物中的吸收、分配及其作用探討[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

7 王舟;結(jié)縷草（Zoysia japonica）抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZjDREB1基因的克隆、表達(dá)模式及功能分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 韋善君;結(jié)縷草抗寒性及轉(zhuǎn)錄因子CBF1的轉(zhuǎn)化研究[D];華中科技大學(xué);2006年

9 章家長;P_（SAG12）-ipt基因?qū)胙泳徶腥A結(jié)樓草衰老研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 謝曉鴻;延長溝葉結(jié)縷草草坪綠色期的研究[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2011年

2 謝詩;外源鈣對(duì)干旱脅迫下結(jié)縷草生長的緩解作用[D];遼寧大學(xué);2013年

3 胡立群;低溫、干旱脅迫對(duì)結(jié)縷草生理生化特性的影響[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 魏花朵;養(yǎng)分異質(zhì)對(duì)結(jié)縷草克隆分株生理特性的影響[D];遼寧大學(xué);2015年

5 趙羽楠;養(yǎng)分異質(zhì)對(duì)結(jié)縷草克隆分株光合和熒光特性的影響[D];遼寧大學(xué);2015年

6 畢波;溝葉結(jié)縷草輻射誘導(dǎo)的矮化突變體研究[D];浙江大學(xué);2016年

7 樊波;結(jié)縷草中鹽脅迫響應(yīng)基因的克隆與功能研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2016年

8 劉俊祥;結(jié)縷草對(duì)鎘脅迫生理響應(yīng)機(jī)制的研究[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2009年

9 賈蘊(yùn)琪;結(jié)縷草綠期與抗寒性研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

10 程忠恕;溝葉結(jié)縷草組織培養(yǎng)技術(shù)體系的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)縷草中鹽脅迫響應(yīng)基因的克隆與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：395567