為了研究甜菜BvMTP11基因(LOC104886952)在重金屬Cd逆境脅迫過(guò)程中的分子功能,明確其在細(xì)胞重金屬解毒中的作用,本研究將BvMTP11基因構(gòu)建于E.coli原核表達(dá)載體pEASY-Blunt E1上,并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。SDS-PAGE電泳表明,通過(guò)1 mmol·L^-1 IPTG的誘導(dǎo),在大腸桿菌總蛋白46 kDa左右的位置上,獲得了重組菌表達(dá)的his tag-BvMTP11的融合蛋白。當(dāng)施加0.5 mmol·L^-1的CdCl₂重金屬逆境脅迫后,對(duì)照菌的生長(zhǎng)受到了較為嚴(yán)重的抑制。相反,過(guò)量表達(dá)BvMTP11蛋白的重組菌表現(xiàn)出了較好的生長(zhǎng)狀態(tài),并且其體內(nèi)的鎘離子含量也要遠(yuǎn)低于對(duì)照菌。這說(shuō)明,甜菜BvMTP11基因可以在一定程度上提高E.coli對(duì)Cd²⁺的耐受性,并有可能通過(guò)對(duì)Cd²⁺的轉(zhuǎn)運(yùn)和富集來(lái)解毒重金屬對(duì)細(xì)胞的傷害。研究結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了甜菜BvMTP11在鎘逆境脅迫分子機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。

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圖1甜菜BvMTP11基因的PCR擴(kuò)增

2結(jié)果與分析2.1pEASY-BluntE1-BvMTP11大腸桿菌原核表達(dá)載體的構(gòu)建

圖2pEASY-BluntE1-BvMTP11表達(dá)載體的鑒定

將PCR產(chǎn)物連接到pEASY-BluntE1Expressionvector上,并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1中。挑取Amp陽(yáng)性克隆培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒提取,通過(guò)載體上的XbaI位點(diǎn)和目的基因終止子后的XhoI位點(diǎn)進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定,分別在5610bp和1350bp左右....

圖4大腸桿菌在重金屬鎘逆境下的耐受性分析

2.3鎘逆境脅迫下過(guò)量表達(dá)BvMTP11的大腸桿菌的耐受性分析為了分析甜菜BvMTP11基因在鎘逆境下的作用機(jī)制,分析了過(guò)量表達(dá)BvMTP11蛋白的大腸桿菌在重金屬鎘逆境下的生長(zhǎng)情況。將濃度為OD600=0.5的兩組待測(cè)菌株原液分別稀釋10、100、1000和10000倍....

圖3SDS-PAGE分析Histag-BvMTP11融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):(a)pEASY-BluntE1(對(duì)照);(b)pEASY-BluntE1-BvMTP11

分別將pEASY-BluntE1對(duì)照空載體和重組質(zhì)粒pEASY-BluntE1-BvMTP11轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中。加入1mmol·L-1的IPTG于OD600=0.5的菌液中,進(jìn)行時(shí)間梯度誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),結(jié)果如圖3所示。圖3(a)的SDS-PAGE電泳結(jié)....

本文編號(hào)：3949263