碳酸酐酶家族(Carbonic anhydrases,CAs),兩步反應(yīng)催化CO₂的可逆水合反應(yīng)(CO₂+H₂O?H₂CO₃?HCO^3-+H⁺)以形成碳酸氫鹽和質(zhì)子以維持胞內(nèi)、胞外酸堿平衡。碳酸酐酶Ⅲ(Carbonic anhydraseⅢ,CAⅢ)屬于CA家族,但是在組織分布、催化CO₂活性上都與其它同工酶不同。主要是因為CAⅢ蛋白64位氨基酸的改變(His→Lys)及兩個半胱氨酸和兩個反應(yīng)性的巰基。目前,CAⅢ基因主要在人、鼠肌肉和脂肪表型進行研究,而豬上對細胞增殖的表型研究相對較少。因此本試驗通過RT-PCR和克隆測序獲得豬CAⅢ基因的CDS序列;通過生物信息學技術(shù)預測該基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、定位等;利用qRT-PCR技術(shù)檢測CAⅢ基因的時空表達特征;利用同源重組方法和CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建pcDNA 3.1-EGFP-CAⅢ過表達載體及敲除載體,并轉(zhuǎn)染至PK15細胞中,qRT-PCR檢測細...

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1α、β、γ、ζ-CA家族的結(jié)構(gòu)

3圖1-1α、β、γ、ζ-CA家族的結(jié)構(gòu)Fig.1-1Structureoftheα,β,γ,ζofCAfamily1.2碳酸酐酶作用機制CA具有高催化效率，其中CAII轉(zhuǎn)化效率為1.1μs-1[14]。CAII和所有α-CA質(zhì)子轉(zhuǎn)移均是兩步（圖1-3[1]），第一步CO2的親核....

圖1-2α-CA反應(yīng)方程式

3圖1-1α、β、γ、ζ-CA家族的結(jié)構(gòu)Fig.1-1Structureoftheα,β,γ,ζofCAfamily1.2碳酸酐酶作用機制CA具有高催化效率，其中CAII轉(zhuǎn)化效率為1.1μs-1[14]。CAII和所有α-CA質(zhì)子轉(zhuǎn)移均是兩步（圖1-3[1]），第一步CO2的親核....

圖1-3活躍位點機制

4圖1-3活躍位點機制Fig.1-3Activesitemechanism1.3碳酸酐酶作用碳酸酐酶是許多生理過程的主要參與者[17]，如糖異生、信號傳導[18]、CO2/HCO3-的轉(zhuǎn)換[5]，也與腫瘤形成、肥胖和癌癥等多種疾病有關(guān)，被認為是藥物靶標[1]。腫瘤代謝源源不斷的產(chǎn)....

圖1-4CRISPR／Cas9作用機制Fig.1-4CRISPR/Cas9mechanism

6綜上所述，CAⅢ獨特的空間結(jié)構(gòu)使得質(zhì)子轉(zhuǎn)移能力較弱，兩個反應(yīng)性半胱氨酸及兩個反應(yīng)性巰基賦予CAⅢ抗氧化功能。3CRISPR／Cas9系統(tǒng)研究進展3.1CRISPR／Cas9概述CRISPR是由一系列短的高度保守的重復序列[41]以及長度相似的間隔序列間隔組成[42]。從發(fā)現(xiàn)至今....

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