目的:G6PD缺陷癥是常見的單基因遺傳性酶缺陷病,目前尚無根治療法,大規(guī)模人群篩查是目前預(yù)防疾病的主要手段,同時尋找新型治療策略也是世界各國研究的重點(diǎn)。CRISPR/Cas9是一種新型基因編輯技術(shù),具有安全性高、特異性強(qiáng)和精確可靠等優(yōu)點(diǎn),是一種極具臨床應(yīng)用價(jià)值的新技術(shù)。目前,利用CRISPR/Cas9技術(shù)治療假肥大性肌營養(yǎng)不良、地中海貧血、血友病等單基因遺傳病已在多個實(shí)驗(yàn)室開展。本文對重慶地區(qū)兒童進(jìn)行G6PD酶活性和基因篩查,找出最具臨床研究價(jià)值的突變位點(diǎn);利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)修復(fù),為G6PD缺陷癥治療提供新策略。方法:應(yīng)用多色探針熔解曲線法和G6PD/6PGD定量比值法分別檢測G6PD基因突變和酶活性,找出突變頻率高且G6PD酶活性低的突變位點(diǎn)。針對此位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩對sgRNA,構(gòu)建PX458-G6PD-sgRNA重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系后,分別在體內(nèi)和體外采用T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ法(T7EⅠ)和用cas9蛋白酶法檢測每對sgRNA的編輯效率。Sanger測序、G6PD/6PGD比值法、熒光定量RT-PCR和Western Blot分別檢測CRISPR/Cas9定點(diǎn)...

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1：重慶地區(qū)G6PD缺乏癥基因突變頻率

圖1.1：重慶地區(qū)G6PD缺乏癥基因突變頻率Figure1.1MutationfrequencyofG6PDdeficiencygeneinChongqing注：2.2G6PD酶活性結(jié)果將G6PD基因突變的366名兒童召回采集外周靜脈血，用G....

圖2.1pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)質(zhì)粒圖譜

13）封閉液：5%（w/v）脫脂牛奶TBST1.5ml脫脂奶粉0.075g主要儀器熒光倒置顯微鏡OLYMPUS公司流式細(xì)胞分選儀BD公司VeritiPCR儀ABI公司凝膠電泳儀BIO-RAD公司ChemiXT4凝膠成像儀Syngene公司pSp....

圖2.2：針對1376G>T突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)2對sgRNA

圖2.2：針對1376G>T突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)2對sgRNAFigure2.2TwopairsofsgRNAfor1376G>TmutationsiteofG6PDgene

圖2.3Sanger測序驗(yàn)證px458載體構(gòu)建成功Figure2.3SuccessfulConstructionofpx458VectorbySangersequencing

29圖2.3Sanger測序驗(yàn)證px458載體構(gòu)建成功Figure2.3SuccessfulConstructionofpx458VectorbySangersequencing脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293和電穿孔轉(zhuǎn)染K562EK293容易轉(zhuǎn)染，是個....

本文編號：3940379