發(fā)布時間：2017-05-25 03:05

  本文關鍵詞：馬鈴薯miRNA164及其靶基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是內源性的調節(jié)基因轉錄后水平的一類小分子RNA。NAC轉錄因子是一類在植物抗逆信號網絡中發(fā)揮多種生物學功能的轉錄因子,干旱、鹽堿等逆境脅迫能夠誘導植物表達該基因。研究表明miRNA164的靶基因NAC在模式植物擬南芥中參與調控植物的生長發(fā)育以及對生物和非生物脅迫的耐受性。目前在馬鈴薯中關于miRNA164參與調控NAC表達模式的研究尚未見報道。本研究利用mi RNA164/NAC表達模式的保守性,用馬鈴薯中已知的miRNA164序列,通過在線工具對其靶基因進行預測并克隆獲得了其靶基因NAC262,構建了其植物表達載體,轉化馬鈴薯栽培品種“克新3號”獲得了轉基因植株。另外,利用人工miRNA(artificial mi RNA,amiRNA)技術構建了馬鈴薯mi RNA164表達載體,并轉化馬鈴薯栽培品種“甘農薯2號”獲得了轉基因馬鈴薯植株。通過轉基因植株NAC262基因表達量的qRT-PCR分析和形態(tài)學的觀察對miRNA164/NAC的表達模式進行了研究。取得的主要結果如下:1.通過在線工具psRNATarget對miRNA164靶基因進行預測得到3個靶基因。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),這3個靶基因均屬于NAC轉錄因子家族的NAM亞家族,且基因結構具有很高的保守性。2.以NCBI登記的馬鈴薯NAC262基因序列設計特異性引物,通過RT-PCR技術獲得了馬鈴薯轉錄因子基因NAC262的cDNA序列,并構建了CaMV 35S啟動子驅動的NAC262基因的植物表達載體pCPB-NAC262;以馬鈴薯栽培品種“克新3號”無菌試管苗為實驗材料,用農桿菌介導法進行遺傳轉化,經卡那霉素抗性篩選和PCR鑒定獲得了8株轉基因植株。3.利用人工miRNA技術構建了CaMV 35S驅動的馬鈴薯mi RNA164的人工表達載體pCPB121-miR164,以馬鈴薯栽培品種“甘農薯2號”無菌試管苗為實驗材料,經農桿菌介導法的遺傳轉化獲得了10株轉基因植株。4.用PEG6000對轉基因植株進行脅迫處理,利用qRT-PCR對NAC262基因表達量分析結果顯示:在20%的PEG脅迫下,0-8 h內NAC262基因表達量呈現(xiàn)上升的趨勢,在脅迫達到8 h時NAC262基因表達量達到了最大值,在8-32 h時,NAC262基因表達量呈現(xiàn)下調的趨勢;NAC262基因在脅迫的各個時間段根部的表達量高于莖葉組織。轉mi RNA164基因株系T1和T2在PEG脅迫下,NAC262基因相對表達量明顯低于非轉基因“甘農薯2號”植株;而轉NAC262基因株系T3和T4在PEG脅迫下,NAC262基因相對表達量明顯高于非轉基因“克新3號”植株。5.對每個株系隨機的5株進行側根數(shù)目和側根長度統(tǒng)計發(fā)現(xiàn):與非轉基因對照相比,轉miRNA164基因的“甘農薯2號”株系T1和T2側根的數(shù)目明顯的減少,但側根的長度無顯著的變化;而轉NAC262基因的“克新3號”株系T3和T4與非轉基因植株相比,側根的數(shù)目明顯的增多,根的長度變短,且葉片變大,莖稈加粗。綜上所述,NAC262轉錄因子能夠調控植物側根的發(fā)育,且表達受到miRNA164的調控,miRNA164/NAC的表達模式存在高度的保守性,與擬南芥的類似,同時受PEG脅迫的誘導而參與了植物對干旱脅迫的響應。
【關鍵詞】：馬鈴薯 miRNA164 NAC轉錄因子 人工miRNA
【學位授予單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 縮略語表6-7
• 摘要7-9
• Summary9-11
• 第一章 文獻綜述11-21
• 1.1 microRNA概述11-15
• 1.1.1 microRNA的發(fā)現(xiàn)11-12
• 1.1.2 miRNA的研究進展12-13
• 1.1.3 植物miRNA的特點13
• 1.1.4 植物miRNA的作用機制13-14
• 1.1.5 植物miRNA的功能14-15
• 1.1.5.1 miRNA與植物的生長發(fā)育14-15
• 1.1.5.2 miRNA與植物抗逆境脅迫15
• 1.2 轉錄因子15-18
• 1.2.1 轉錄因子的基本特征15-16
• 1.2.2 NAC轉錄因子的基本特點16-18
• 1.2.3 NAC轉錄因子的研究進展18
• 1.3 本研究的目的和意義18-20
• 1.4 技術路線20-21
• 第二章 材料與方法21-42
• 2.1 實驗材料21-23
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 菌株和載體21
• 2.1.3 數(shù)據(jù)庫與分析軟件21-22
• 2.1.4 試劑及儀器22
• 2.1.5 培養(yǎng)基的配制22-23
• 2.2 實驗方法23-42
• 2.2.1 miRNA164靶基因的預測23-24
• 2.2.2 靶基因生物信息學分析24
• 2.2.3 引物的設計與合成24
• 2.2.4 馬鈴薯NAC262基因的克隆24-28
• 2.2.4.1 馬鈴薯試管薯總RNA的提取24-25
• 2.2.4.2 cDNA第一鏈的合成25-26
• 2.2.4.3 馬鈴薯NAC262基因的PCR擴增26
• 2.2.4.4 PCR產物純化回收26-27
• 2.2.4.5 目的片段與克隆載體的連接27
• 2.2.4.6 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備27
• 2.2.4.7 連接產物的轉化27-28
• 2.2.5 miR164克隆載體的構建28-31
• 2.2.5.1 miR164前體片段的PCR擴增28-30
• 2.2.5.2 d片段與克隆載體pMD®18-T的連接30-31
• 2.2.6 馬鈴薯NAC262基因和miR164植物表達載體的構建31-36
• 2.2.6.1 馬鈴薯NAC262基因表達載體的構建原理31-32
• 2.2.6.2 表達載體pCPB121的構建32-33
• 2.2.6.3 馬鈴薯表達載體pCPB121-miR164的構建33-34
• 2.2.6.4 質粒DNA的提取34
• 2.2.6.5 表達載體pCPB和克隆載體pMD-NAC262雙酶切34
• 2.2.6.6 表達載體pCPB121和克隆載體pMD-miR164雙酶切34
• 2.2.6.7 酶切產物的回收34-35
• 2.2.6.8 NAC262目的片段與pCPB表達載體的連接35
• 2.2.6.9 miR164目的片段與pCPB121表達載體片段的連接35-36
• 2.2.7 馬鈴薯的遺傳轉化36-38
• 2.2.7.1 農桿菌感受態(tài)細胞的制備36
• 2.2.7.2 表達載體pCPB-NAC262和pCPB121-miR164農桿菌感受態(tài)細胞的轉化36-37
• 2.2.7.3 農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化37-38
• 2.2.8 轉基因植株的檢測38-40
• 2.2.8.1 馬鈴薯基因組DNA的提取38-40
• 2.2.8.2 轉化植株NPTⅡ基因的PCR檢測40
• 2.2.9 轉基因馬鈴薯植株的抗旱性檢測40-41
• 2.2.9.1 PEG脅迫濃度的選擇40
• 2.2.9.2 轉基因植株的PEG脅迫處理40
• 2.2.9.3 qRT-PCR檢測40-41
• 2.2.10 轉基因植株生理指標測定41-42
• 第三章 結果與分析42-57
• 3.1 馬鈴薯miRNA164靶基因預測42-43
• 3.2 靶基因生物信息學分析43-45
• 3.2.1 靶基因進化分析43-44
• 3.2.2 靶基因結構分析44-45
• 3.3 馬鈴薯NAC262基因的克隆45-47
• 3.3.1 馬鈴薯試管薯總RNA的提取45
• 3.3.2 NAC262基因的克隆45-46
• 3.3.3 克隆載體pMD-NAC262雙酶切驗證46-47
• 3.4 ami R164克隆載體的構建47-49
• 3.4.1 amiR164前體片段的PCR擴增47
• 3.4.2 d片段測序分析47-48
• 3.4.3 克隆載體pMD-miR164雙酶切驗證48-49
• 3.5 馬鈴薯NAC262基因和miR164植物表達載體的構建49-50
• 3.5.1 表達載體pCPB-NAC262雙酶切驗證49
• 3.5.2 表達載體pCPB121-miR164雙酶切驗證49-50
• 3.6 馬鈴薯遺傳轉化50-51
• 3.6.1 馬鈴薯試管薯的誘導50-51
• 3.6.2 農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化51
• 3.7 轉化植株NPTⅡ基因的PCR檢測51-52
• 3.8 qRT-PCR分析52-55
• 3.8.1 NAC262基因組織特異性表達分析52-53
• 3.8.2 PEG脅迫下轉基因馬鈴薯植株NAC262基因表達量分析53-55
• 3.9 轉基因植株生理指標測定55-57
• 第四章 討論與展望57-60
• 4.1 討論57-58
• 4.2 結論58-59
• 4.3 展望59-60
• 參考文獻60-65
• 致謝65-66
• 作者簡介66-67
• 導師簡介67-68

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊致榮,王興春,李西明,楊長登;高等植物轉錄因子的研究進展[J];遺傳;2004年03期

  本文關鍵詞：馬鈴薯miRNA164及其靶基因功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：392565