本文關(guān)鍵詞：馬鈴薯miRNA164及其靶基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性的調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后水平的一類小分子RNA。NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類在植物抗逆信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮多種生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子,干旱、鹽堿等逆境脅迫能夠誘導(dǎo)植物表達(dá)該基因。研究表明miRNA164的靶基因NAC在模式植物擬南芥中參與調(diào)控植物的生長發(fā)育以及對生物和非生物脅迫的耐受性。目前在馬鈴薯中關(guān)于miRNA164參與調(diào)控NAC表達(dá)模式的研究尚未見報道。本研究利用mi RNA164/NAC表達(dá)模式的保守性,用馬鈴薯中已知的miRNA164序列,通過在線工具對其靶基因進(jìn)行預(yù)測并克隆獲得了其靶基因NAC262,構(gòu)建了其植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培品種“克新3號”獲得了轉(zhuǎn)基因植株。另外,利用人工miRNA(artificial mi RNA,amiRNA)技術(shù)構(gòu)建了馬鈴薯mi RNA164表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培品種“甘農(nóng)薯2號”獲得了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。通過轉(zhuǎn)基因植株NAC262基因表達(dá)量的qRT-PCR分析和形態(tài)學(xué)的觀察對miRNA164/NAC的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。取得的主要結(jié)果如下:1.通過在線工具psRNATarget對miRNA164靶基因進(jìn)行預(yù)測得到3個靶基因。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),這3個靶基因均屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的NAM亞家族,且基因結(jié)構(gòu)具有很高的保守性。2.以NCBI登記的馬鈴薯NAC262基因序列設(shè)計特異性引物,通過RT-PCR技術(shù)獲得了馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因子基因NAC262的cDNA序列,并構(gòu)建了CaMV 35S啟動子驅(qū)動的NAC262基因的植物表達(dá)載體pCPB-NAC262;以馬鈴薯栽培品種“克新3號”無菌試管苗為實(shí)驗(yàn)材料,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR鑒定獲得了8株轉(zhuǎn)基因植株。3.利用人工miRNA技術(shù)構(gòu)建了CaMV 35S驅(qū)動的馬鈴薯mi RNA164的人工表達(dá)載體pCPB121-miR164,以馬鈴薯栽培品種“甘農(nóng)薯2號”無菌試管苗為實(shí)驗(yàn)材料,經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了10株轉(zhuǎn)基因植株。4.用PEG6000對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行脅迫處理,利用qRT-PCR對NAC262基因表達(dá)量分析結(jié)果顯示:在20%的PEG脅迫下,0-8 h內(nèi)NAC262基因表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢,在脅迫達(dá)到8 h時NAC262基因表達(dá)量達(dá)到了最大值,在8-32 h時,NAC262基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢;NAC262基因在脅迫的各個時間段根部的表達(dá)量高于莖葉組織。轉(zhuǎn)mi RNA164基因株系T1和T2在PEG脅迫下,NAC262基因相對表達(dá)量明顯低于非轉(zhuǎn)基因“甘農(nóng)薯2號”植株;而轉(zhuǎn)NAC262基因株系T3和T4在PEG脅迫下,NAC262基因相對表達(dá)量明顯高于非轉(zhuǎn)基因“克新3號”植株。5.對每個株系隨機(jī)的5株進(jìn)行側(cè)根數(shù)目和側(cè)根長度統(tǒng)計發(fā)現(xiàn):與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?轉(zhuǎn)miRNA164基因的“甘農(nóng)薯2號”株系T1和T2側(cè)根的數(shù)目明顯的減少,但側(cè)根的長度無顯著的變化;而轉(zhuǎn)NAC262基因的“克新3號”株系T3和T4與非轉(zhuǎn)基因植株相比,側(cè)根的數(shù)目明顯的增多,根的長度變短,且葉片變大,莖稈加粗。綜上所述,NAC262轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物側(cè)根的發(fā)育,且表達(dá)受到miRNA164的調(diào)控,miRNA164/NAC的表達(dá)模式存在高度的保守性,與擬南芥的類似,同時受PEG脅迫的誘導(dǎo)而參與了植物對干旱脅迫的響應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：馬鈴薯 miRNA164 NAC轉(zhuǎn)錄因子 人工miRNA
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 縮略語表6-7
• 摘要7-9
• Summary9-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-21
• 1.1 microRNA概述11-15
• 1.1.1 microRNA的發(fā)現(xiàn)11-12
• 1.1.2 miRNA的研究進(jìn)展12-13
• 1.1.3 植物miRNA的特點(diǎn)13
• 1.1.4 植物miRNA的作用機(jī)制13-14
• 1.1.5 植物miRNA的功能14-15
• 1.1.5.1 miRNA與植物的生長發(fā)育14-15
• 1.1.5.2 miRNA與植物抗逆境脅迫15
• 1.2 轉(zhuǎn)錄因子15-18
• 1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子的基本特征15-16
• 1.2.2 NAC轉(zhuǎn)錄因子的基本特點(diǎn)16-18
• 1.2.3 NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展18
• 1.3 本研究的目的和意義18-20
• 1.4 技術(shù)路線20-21
• 第二章 材料與方法21-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 菌株和載體21
• 2.1.3 數(shù)據(jù)庫與分析軟件21-22
• 2.1.4 試劑及儀器22
• 2.1.5 培養(yǎng)基的配制22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-42
• 2.2.1 miRNA164靶基因的預(yù)測23-24
• 2.2.2 靶基因生物信息學(xué)分析24
• 2.2.3 引物的設(shè)計與合成24
• 2.2.4 馬鈴薯NAC262基因的克隆24-28
• 2.2.4.1 馬鈴薯試管薯總RNA的提取24-25
• 2.2.4.2 cDNA第一鏈的合成25-26
• 2.2.4.3 馬鈴薯NAC262基因的PCR擴(kuò)增26
• 2.2.4.4 PCR產(chǎn)物純化回收26-27
• 2.2.4.5 目的片段與克隆載體的連接27
• 2.2.4.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備27
• 2.2.4.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化27-28
• 2.2.5 miR164克隆載體的構(gòu)建28-31
• 2.2.5.1 miR164前體片段的PCR擴(kuò)增28-30
• 2.2.5.2 d片段與克隆載體pMD®18-T的連接30-31
• 2.2.6 馬鈴薯NAC262基因和miR164植物表達(dá)載體的構(gòu)建31-36
• 2.2.6.1 馬鈴薯NAC262基因表達(dá)載體的構(gòu)建原理31-32
• 2.2.6.2 表達(dá)載體pCPB121的構(gòu)建32-33
• 2.2.6.3 馬鈴薯表達(dá)載體pCPB121-miR164的構(gòu)建33-34
• 2.2.6.4 質(zhì)粒DNA的提取34
• 2.2.6.5 表達(dá)載體pCPB和克隆載體pMD-NAC262雙酶切34
• 2.2.6.6 表達(dá)載體pCPB121和克隆載體pMD-miR164雙酶切34
• 2.2.6.7 酶切產(chǎn)物的回收34-35
• 2.2.6.8 NAC262目的片段與pCPB表達(dá)載體的連接35
• 2.2.6.9 miR164目的片段與pCPB121表達(dá)載體片段的連接35-36
• 2.2.7 馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化36-38
• 2.2.7.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備36
• 2.2.7.2 表達(dá)載體pCPB-NAC262和pCPB121-miR164農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化36-37
• 2.2.7.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化37-38
• 2.2.8 轉(zhuǎn)基因植株的檢測38-40
• 2.2.8.1 馬鈴薯基因組DNA的提取38-40
• 2.2.8.2 轉(zhuǎn)化植株NPTⅡ基因的PCR檢測40
• 2.2.9 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的抗旱性檢測40-41
• 2.2.9.1 PEG脅迫濃度的選擇40
• 2.2.9.2 轉(zhuǎn)基因植株的PEG脅迫處理40
• 2.2.9.3 qRT-PCR檢測40-41
• 2.2.10 轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)測定41-42
• 第三章 結(jié)果與分析42-57
• 3.1 馬鈴薯miRNA164靶基因預(yù)測42-43
• 3.2 靶基因生物信息學(xué)分析43-45
• 3.2.1 靶基因進(jìn)化分析43-44
• 3.2.2 靶基因結(jié)構(gòu)分析44-45
• 3.3 馬鈴薯NAC262基因的克隆45-47
• 3.3.1 馬鈴薯試管薯總RNA的提取45
• 3.3.2 NAC262基因的克隆45-46
• 3.3.3 克隆載體pMD-NAC262雙酶切驗(yàn)證46-47
• 3.4 ami R164克隆載體的構(gòu)建47-49
• 3.4.1 amiR164前體片段的PCR擴(kuò)增47
• 3.4.2 d片段測序分析47-48
• 3.4.3 克隆載體pMD-miR164雙酶切驗(yàn)證48-49
• 3.5 馬鈴薯NAC262基因和miR164植物表達(dá)載體的構(gòu)建49-50
• 3.5.1 表達(dá)載體pCPB-NAC262雙酶切驗(yàn)證49
• 3.5.2 表達(dá)載體pCPB121-miR164雙酶切驗(yàn)證49-50
• 3.6 馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化50-51
• 3.6.1 馬鈴薯試管薯的誘導(dǎo)50-51
• 3.6.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化51
• 3.7 轉(zhuǎn)化植株NPTⅡ基因的PCR檢測51-52
• 3.8 qRT-PCR分析52-55
• 3.8.1 NAC262基因組織特異性表達(dá)分析52-53
• 3.8.2 PEG脅迫下轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株NAC262基因表達(dá)量分析53-55
• 3.9 轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)測定55-57
• 第四章 討論與展望57-60
• 4.1 討論57-58
• 4.2 結(jié)論58-59
• 4.3 展望59-60
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 致謝65-66
• 作者簡介66-67
• 導(dǎo)師簡介67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊致榮,王興春,李西明,楊長登;高等植物轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展[J];遺傳;2004年03期

  本文關(guān)鍵詞：馬鈴薯miRNA164及其靶基因功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：392565