本文關(guān)鍵詞：結(jié)球甘藍離體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)FOC1基因植株的獲得，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甘藍枯萎病是多年來導(dǎo)致全世界甘藍質(zhì)量下降、產(chǎn)量嚴(yán)重受損的一種毀滅性的土傳病害[1]。實驗室前期與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所合作,從甘藍中鑒定了一個甘藍枯萎病抗性候選基因FOC1,但一直沒有能夠?qū)@個基因的相關(guān)抗性功能進行相應(yīng)的驗證。本文從甘藍植株的苗齡、不同激素添加濃度組合、Ag NO3濃度等方面研究了它們對再生體系的影響情況,綜合數(shù)據(jù)后建立了甘藍的高效再生體系。再從篩選劑濃度、農(nóng)桿菌抑制劑最適濃度和農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時間長短對甘藍遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響,建立了甘藍遺傳轉(zhuǎn)化的體系。為研究甘藍抗枯萎病基因FOC1在轉(zhuǎn)基因甘藍中的抗性功能,利用本實驗室前期克隆的FOC1基因,以p BI121質(zhì)粒為植物表達載體,利用Infusion方法構(gòu)建FOC1基因的正義表達載體;將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株中,并以表現(xiàn)為高感枯萎病的甘藍自交系213為植物受體材料,該抗性基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功的被轉(zhuǎn)化,獲得了整合FOC1抗性基因的轉(zhuǎn)基因甘藍植株,并利用載體特異引物對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR鑒定。本論文的主要研究結(jié)果如下:1.甘藍外植體高效再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立選擇4d苗齡的甘藍幼苗作為試驗所用受體材料;當(dāng)激素組合濃度為6-BA 3 mg/L+NAA 0.1mg/L時,外植體再生率高達31.4%;本研究的結(jié)果顯示對于此品種的甘藍外植體,Ag NO3并沒有促進分化的作用。對于甘藍的轉(zhuǎn)化,因此選用篩選劑濃度為10 mg/L的Kan對抗性芽進行初步的篩選;農(nóng)桿菌抑菌劑選擇了對農(nóng)桿菌抑制效果好同時對芽生長無影響的特美汀,最適濃度為150 mg/L;農(nóng)桿菌菌液濃度以O(shè)D600為0.5,侵染時間為5min最適合。2.FOC1基因正義表達載體的構(gòu)建根據(jù)實驗室前期利用RACE技術(shù)獲得的FOC1全長序列信息,在目的基因特異的上下游引物的5’端添加與連接載體末端同源的15 bp堿基,以反轉(zhuǎn)錄獲得的c DNA為模板,利用上述設(shè)計的特異引物In-fusion ZY-FOCF/R,擴增FOC1基因的CDS全長。內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ將植物表達載體p BI121雙酶切后,利用Infusion方法與目的片段連接后得到重組載體,最后通過熱激法將重組載體p BI121-35S-FOC1成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10中。3.植物表達載體的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因苗的鑒定重組載體進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化之后,利用農(nóng)桿菌作為媒介,將植物表達載體導(dǎo)入到受體甘藍的植株。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入甘藍受體植株當(dāng)中后,經(jīng)過一系列的共培養(yǎng)及篩選過程,最后共獲得了40株抗卡那霉素的抗性甘藍植株,初步大量提取植物的DNA,PCR檢測有10株為陽性植株。表明重組載體已成功導(dǎo)入到受體甘藍植株中。但其究竟與甘藍植株的基因組是否整合,基因是否能正常表達,是否能翻譯出具有功能的蛋白,還需要進一步通過Southern,Northern和Western等手段進一步驗證。
【關(guān)鍵詞】：甘藍 抗枯萎病基因 pBI121質(zhì)粒 載體構(gòu)建 再生體系 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S635.1
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-6
• 縮略詞表6-9
• 第一章 文獻綜述9-20
• 1.1 植物基因工程概況9-16
• 1.1.1 植物轉(zhuǎn)基因方法和原理9-14
• 1.1.1.1 載體介導(dǎo)法：主要為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化10-11
• 1.1.1.2 DNA直接導(dǎo)入法11-14
• 1.1.1.3 其它14
• 1.1.2 植物轉(zhuǎn)基因研究進展14-16
• 1.2 甘藍再生體系研究進展16-18
• 1.3 甘藍類蔬菜轉(zhuǎn)基因概況18
• 1.3.1 抗蟲基因：主要為Bt基因18
• 1.3.2 抗病基因18
• 1.3.3 育性基因18
• 1.3.4 抗除草劑基因18
• 1.4 研究目的和意義18-20
• 第二章 結(jié)球甘藍外植體高效再生體系的建立20-25
• 2.1 試驗材料20-21
• 2.1.1 植物材料20
• 2.1.2 試驗所用器材20
• 2.1.3 培養(yǎng)基及主要添加成分配制20-21
• 2.2 試驗方法21-22
• 2.2.1 甘藍無菌苗的獲得21-22
• 2.2.2 不同苗齡對不定芽分化的影響22
• 2.2.3 AgNO_3對不定芽分化的影響22
• 2.2.4 激素配比對不定芽分化的影響22
• 2.3 結(jié)果與分析22-25
• 2.3.1 苗齡對不定芽分化的影響22-23
• 2.3.2 AgNO_3對甘藍再生體系的影響23
• 2.3.3 不同濃度組合的 6-BA和NAA對甘藍再生體系的影響23-25
• 第三章 結(jié)球甘藍遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立25-30
• 3.1 試驗材料25
• 3.1.1 甘藍受體材料25
• 3.1.2 菌株和質(zhì)粒材料25
• 3.1.3 培養(yǎng)基及主要添加成分25
• 3.2 試驗方法25-26
• 3.2.1 農(nóng)桿菌菌液的制備25-26
• 3.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化26
• 3.2.3 篩選壓的確定26
• 3.2.4 農(nóng)桿菌抑制劑最適濃度的確定26
• 3.2.5 農(nóng)桿菌菌液濃度及侵染時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響26
• 3.3 結(jié)果與分析26-30
• 3.3.1 篩選劑最適濃度的確定26-27
• 3.3.2 農(nóng)桿菌抑制劑最適濃度的確定27-28
• 3.3.3 菌液濃度及侵染時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響28-30
• 第四章 FOC1植物表達載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化30-40
• 4.1 試驗材料30-31
• 4.1.1 植物材料30
• 4.1.2 菌株和試劑30
• 4.1.3 試驗儀器30
• 4.1.4 培養(yǎng)基和主要添加成分30
• 4.1.5 所用PCR引物30-31
• 4.1.6 培養(yǎng)基31
• 4.2 試驗方法31-35
• 4.2.1 甘藍抗枯萎病基因FOC1正義表達載體的構(gòu)建31-32
• 4.2.1.1 目的片段擴增與載體酶切31-32
• 4.2.1.2 抗枯萎病基因FOC1植物表達載體的構(gòu)建32
• 4.2.2 植物表達載體pBI121-35S-FOC1的轉(zhuǎn)化32-34
• 4.2.2.1 根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備32-33
• 4.2.2.2 重組質(zhì)粒pBI121-35S-FOC1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌33
• 4.2.2.3 農(nóng)桿菌侵染甘藍植株33-34
• 4.2.3 轉(zhuǎn)基因甘藍植株的鑒定34-35
• 4.2.3.1 CTAB法大量提取甘藍葉片DNA34
• 4.2.3.2 轉(zhuǎn)基因甘藍植株的PCR鑒定34-35
• 4.3 結(jié)果與分析35-40
• 4.3.1 甘藍抗枯萎病基因FOC1正義表達載體的構(gòu)建35-36
• 4.3.2 植物表達載體pBI121-35S-FOC1的鑒定36-37
• 4.3.3 植物表達載體pBI121-35S-FOC1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的檢測37-38
• 4.3.4 甘藍轉(zhuǎn)基因植株的獲得38
• 4.3.5 轉(zhuǎn)基因甘藍植株的PCR檢測38-40
• 第五章 討論與結(jié)論40-43
• 5.1 討論40-42
• 5.1.1 苗齡、AgNO_3和最適激素配比對甘藍再生體系中的影響40-41
• 5.1.2 農(nóng)桿菌菌液濃度與侵染時間的確定41
• 5.1.3 甘藍遺傳轉(zhuǎn)化體系中篩選劑和農(nóng)桿菌抑制劑濃度的確定41-42
• 5.2 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-49
• 致謝49-50
• 作者簡介50-51
• 導(dǎo)師簡介51-52

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：結(jié)球甘藍離體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)FOC1基因植株的獲得，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：389627