肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一,也是全球癌癥相關(guān)致死的主要原因之一。在檢出的肺癌患者中,有80%-85%為非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC),且其中大部分病例在確診時已是中晚期,五年生存率僅為10%-15%。NSCLC的傳統(tǒng)治療包括手術(shù)、化療和放療等手段,但隨著近年來研究者對NSCLC研究的不斷深入以及精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展,依據(jù)患者的遺傳信息以制定個體化治療方案在NSCLC治療中的作用日益凸顯。目前,已有一系列NSCLC靶向治療相關(guān)的基因突變和基因重排分子檢測在臨床上得以廣泛應(yīng)用。其中人類棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣 4(Echinoderm microtubule-associated protein like 4,EML4 基因和人類間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因重排形成的融合基因,即EML4-ALK融合基因檢測即被證明可用于指導(dǎo)NSCLC患者進(jìn)行克唑替尼靶向治療。目前,EML4-ALK融合基因的常用檢測方法有免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)、熒光原位雜交(Fl...

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【學(xué)位級別】：博士

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前言
1. 材料和方法
    1.1 實驗材料和試劑配制
        1.1.1 實驗儀器
        1.1.2 實驗耗材
        1.1.3 實驗試劑
        1.1.4 溶液配制
        1.1.5 細(xì)胞系
        1.1.6 菌株及載體
        1.1.7 實驗動物
    1.2 實驗方法
        1.2.1 HEK293T細(xì)胞系及各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)
            1.2.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            1.2.1.2 細(xì)胞換液
            1.2.1.3 細(xì)胞計數(shù)及傳代
            1.2.1.4 細(xì)胞凍存
        1.2.2 HEK293T細(xì)胞系EML4-ALK融合基因狀態(tài)驗證
            1.2.2.1 HEK293T、H3122及H2228細(xì)胞總RNA提取
            1.2.2.2 RT-qPCR方法驗證HEK293T細(xì)胞EML4-ALK融合基因狀態(tài)
        1.2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建EML4-ALK融合基因陽性細(xì)胞系
            1.2.3.1 靶位點選擇及sgRNA設(shè)計
            1.2.3.2 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
            1.2.3.3 攜帶不同sgRNA的CRISPR/Cas9表達(dá)載體篩選
            1.2.3.4 EML4-ALK融合基因陽性混合克隆制備及驗證
            1.2.3.5 EML4-ALK融合基因陽性單克隆細(xì)胞篩選
        1.2.4 基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的EML4-ALK融合基因陽性細(xì)胞系驗證
            1.2.4.1 DNA水平驗證
            1.2.4.2 RNA水平驗證
            1.2.4.3 蛋白水平驗證
        1.2.5 攜帶相關(guān)EML4-ALK融合基因的異種移植動物模型建立
            1.2.5.1 實驗動物的準(zhǔn)備
            1.2.5.2 接種細(xì)胞懸液制備
            1.2.5.3 動物接種
            1.2.5.4 異種移植成瘤觀察及動物處死
        1.2.6 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)制備及驗證
            1.2.6.1 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)制備
            1.2.6.2 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)IHC方法驗證
            1.2.6.3 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)FISH方法驗證
            1.2.6.4 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)RT-qPCR方法驗證
            1.2.6.5 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)NGS方法驗證
        1.2.7 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)均一性及穩(wěn)定性探究
            1.2.7.1 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)均一性研究
            1.2.7.2 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)穩(wěn)定性研究
2. 結(jié)果
    2.1 HEK293T細(xì)胞系及各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)及EML4-ALK融合基因狀態(tài)驗證
        2.1.1 HEK293T細(xì)胞系及各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)
        2.1.2 HEK293T細(xì)胞系EML4-ALK融合基因狀態(tài)驗證
    2.2 CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建EML4-ALK融合基因陽性細(xì)胞系
        2.2.1 EML4-ALK融合基因靶向sgRNA設(shè)計
        2.2.2 pX330載體驗證
        2.2.3 pX330-sgRNA重組質(zhì)粒載體驗證
        2.2.4 pX330-sgRNA重組質(zhì)粒載體篩選
        2.2.5 混合克隆制備及驗證
        2.2.6 單克隆細(xì)胞篩選
    2.3 新型EML4-ALK融合基因陽性細(xì)胞系驗證
        2.3.1 DNA水平驗證
        2.3.2 RNA水平驗證
        2.3.3 蛋白質(zhì)水平驗證
    2.4 異種移植動物模型建立
    2.5 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)制備及驗證
        2.5.1 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)制備
        2.5.2 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)IHC方法驗證
        2.5.3 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)FISH方法驗證
        2.5.4 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)RT-qPCR方法驗證
        2.5.5 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)NGS方法驗證
    2.6 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)均一性及穩(wěn)定性探究
        2.6.1 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)均一性驗證
        2.6.2 新型EML4-ALK融合基因參考物質(zhì)穩(wěn)定性驗證
3. 討論
參考文獻(xiàn)
論文綜述
    References
附錄
    附錄1 PX330載體信息
        1. pX330載體結(jié)構(gòu)
        2. pX330載體位點
        3. pX330載體序列
    附錄2 PEGFP-1載體信息
        1. pEGFP-1載體結(jié)構(gòu)
        2. pEGFP-1載體位點
        3. pEGFP-1載體序列
    附錄3 PMD18-T載體信息
        1. pMD18-T載體結(jié)構(gòu)
        2. pMD18-T載體位點
        3. pMD18-T載體序列
    附錄4 EML4-ALK融合基因V1型、V2型及V3型MRNA序列信息
        1. EML4-ALK融合基因V1型mRNA序列信息
        2. EML4-ALK融合基因V2型mRNA序列信息
        3. EML4-ALK融合基因V3a型mRNA序列信息
        4. EML4-ALK融合基因V3b型mRNA序列信息
    附錄5 EML4基因及ALK基因MRNA序列信息
        1. EML4基因mRNA序列信息
        2. ALK基因mRNA序列信息
    附錄6 EML4基因INTRON 13/INTRON 20/INTRON 6及ALK基因INTRON 19序列信息
        1. EML4基因intron 13序列信息
        2. EML4基因intron 20序列信息
        3. EML4基因intron 6序列信息
        4. ALK基因intron 19序列信息
致謝
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本文編號：3906655