真核細胞的染色質(zhì)可以分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)。己有的研究表明,異染色質(zhì)在調(diào)控基因表達、維持基因組穩(wěn)定性、細胞的發(fā)育分化以及腫瘤的表觀調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。至今,異染色質(zhì)的形成及其功能一直沒有完全研究清楚。已有的研究已經(jīng)比較清楚地表明,裂殖酵母利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)機制在細胞核中染色質(zhì)水平上直接介導異染色質(zhì)的形成。Hsp90作為分子伴侶蛋白家族的一個特殊成員。它不僅參與蛋白的正確折疊維持蛋白穩(wěn)態(tài),而且參與許多重要的生物進程。近期的研究表明,在高等生物中熱激蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)參與RNA誘導沉默復合物復合物(RISC)的組裝從而影響RNAi介導的基因沉默。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),裂殖酵母中Hsp90突變體swol-26可以不同程度地解除插入在近著絲粒區(qū)、交配型區(qū)和rDNA區(qū)的報道基因的沉默。在此基礎上,本研究的遺傳學實驗表明swol-26突變體可以使得在異位建立的RNAi介導的基因沉默產(chǎn)生缺陷,并且特異的破壞異染色質(zhì)區(qū)的Hsp90導致近著絲粒區(qū)嚴重的基因沉默缺陷。通過生化實驗,我們發(fā)現(xiàn)swol-26影響R...

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【學位級別】：碩士

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縮寫詞表
摘要
英文摘要
第一章 前言
    1 裂殖酵母中異染色質(zhì)區(qū)
    2 RNAi與異染色質(zhì)形成
        2.1 小干擾RNA的生成
        2.2 siRNA的代謝
        2.3 包含Ago1的基因沉默復合物
        2.4 RNAi正循環(huán)
        2.5 異染色質(zhì)蛋白與異染色質(zhì)的形成
        2.6 RNAi介導亞端粒區(qū)異染色質(zhì)的形成
        2.7 Shelterin復合物介導近端粒區(qū)異染色質(zhì)的形成
    3 熱激蛋白HsP90
        3.1 人類細胞Hsp90
        3.2 Hsp90參與RNAi
    4 本論文的研究目的、內(nèi)容和意義
第二章 材料和方法
    1 材料
        1.1 大腸桿菌
        1.2 酵母菌株
        1.3 質(zhì)粒
        1.4 引物
        1.5 分子生物學工具酶
        1.6 主要試劑及耗材
        1.7 主要儀器及設備
        1.8 常用培養(yǎng)基以及主要緩沖液的配制
    2 方法
        2.1 裂殖酵母菌株的構(gòu)建
        2.2 裂殖酵母基因組的粗提取—硅酸鋯珠破碎法
        2.3 裂殖酵母的轉(zhuǎn)化
        2.4 質(zhì)粒DNA的提取
        2.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
        2.6 質(zhì)粒DNA的細菌轉(zhuǎn)化
        2.7 常規(guī)PCR
        2.8 定點誘變PCR
        2.9 T-type構(gòu)建質(zhì)粒
        2.10 梯度稀釋實驗(Drop test)
        2.11 免疫印跡檢測(Western blot)
        2.12 免疫共沉淀(Co-IP)
        2.13 MBP-Hsp90(TEV sites)大腸桿菌的誘導表達及純化
        2.14 TEV體外酶切實驗
        2.15 轉(zhuǎn)盤激光共聚焦顯微鏡使用
        2.16 RT-PCR
第三章 實驗結(jié)果和分析
    1 特異破壞近著絲粒區(qū)的HSP90導致基因沉默的嚴重缺陷
    2 Hsp90調(diào)控含有Argonaute蛋白的基因沉默復合物的組裝
    3 Hsp90與RITS復合物存在相互作用
    4 Hsp90調(diào)控SHREC復合物的組裝參與異染色質(zhì)基因沉默
    5 Hsp90調(diào)控Shelterin復合物的組裝參與亞端粒區(qū)異染色質(zhì)基因沉默
    6 Hsp90影響Shelterin復合物招募CLRC和SHREC復合物到亞端粒異染色質(zhì)區(qū)
    7 epe1⊿和mst2⊿缺失突變可以逆轉(zhuǎn)swo1-26突變體中的基因沉默的缺陷
第四章 討論
參考文獻
致謝



本文編號：3899887