NOLC1蛋白是一個(gè)高度磷酸化的哺乳動(dòng)物蛋白,既參與核仁的發(fā)生和rDNA的轉(zhuǎn)錄,又參與炎癥發(fā)生、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控。已有研究報(bào)道,在鼻咽癌和肝癌的發(fā)生發(fā)展中,NOLC1起著至關(guān)重要的作用。但是,關(guān)于NOLC1蛋白在肺癌細(xì)胞中的作用還未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)TOPO克隆法成功構(gòu)建入門載體pENTR/D-TOPO-NOLC1,利用通路克隆系統(tǒng)技術(shù)成功構(gòu)建pAd-CMV-V5-NOLC1表達(dá)載體,成功包裝成腺病毒后,qRT-PCR和Western blot分別比較不同(5-100)MOIs的腺病毒感染A549細(xì)胞和HEL細(xì)胞后,兩種細(xì)胞中NOLC1 mRNA量和蛋白量的表達(dá)情況。結(jié)果顯示MOI=100時(shí),兩種細(xì)胞NOLC1的mRNA量和蛋白量最高,后續(xù)病毒感染實(shí)驗(yàn)均采用100MOI。MTT實(shí)驗(yàn)分析感染Ad-V5-NOLC1(過(guò)表達(dá))和轉(zhuǎn)染shRNA-NOLC1質(zhì)粒(干擾)對(duì)HEL和A549細(xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示：NOLC1蛋白的過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá)均促進(jìn)A549細(xì)胞的活性降低,但是對(duì)HEL細(xì)胞影響很小。為確定細(xì)胞活性減少是由細(xì)胞凋亡引起還是由細(xì)胞壞死引起,采用An...

【文章頁(yè)數(shù)】：57 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
    0.1 肺癌的基因治療
    0.2 基因治療載體
    0.3 NOLC1蛋白簡(jiǎn)介
    0.4 細(xì)胞凋亡
    0.5 本項(xiàng)目研究目的、內(nèi)容及意義
第1章 重組NOLC1腺病毒載體的構(gòu)建及其鑒定
    1.1 實(shí)驗(yàn)方案
    1.2 材料
        1.2.1 引物設(shè)計(jì)
        1.2.2 載體、細(xì)菌菌株
        1.2.3 主要試劑
        1.2.4 溶液配制(見(jiàn)附錄A)
        1.2.5 主要儀器及耗材(見(jiàn)附錄B)
    1.3 方法
        1.3.1 pENTR/D-TOPO-NOLC1重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.3.2 重組pAd-CMV-V5-NOLC1腺病毒載體的構(gòu)建
    1.4 結(jié)果
        1.4.1 pENTR/D-TOPO-NOLC1重組質(zhì)粒的PCR鑒定
        1.4.2 重組pAd-CMV-V5-NOLC1質(zhì)粒的PCR鑒定
    1.5 討論
第2章 重組NOLC1腺病毒表達(dá)載體的包裝及鑒定
    2.1 實(shí)驗(yàn)方案
    2.2 材料
        2.2.1 細(xì)胞株、載體、細(xì)菌菌株
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 溶液配制(見(jiàn)附錄A)
        2.2.4 主要儀器及耗材(見(jiàn)附錄B)
    2.3 方法
        2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3.2 腺病毒包裝
        2.3.3 重組腺病毒表達(dá)載體的Western blot驗(yàn)證
        2.3.4 重組腺病毒的TCID50測(cè)定(組織半數(shù)感染量)
        2.3.5 Real-time PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中mRNA表達(dá)量
        2.3.6 Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá)量
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 腺病毒包裝結(jié)果
        2.4.2 重組腺病毒表達(dá)載體的Western blot驗(yàn)證
        2.4.3 重組腺病毒滴度TCID50的測(cè)定
        2.4.4 Real-time PCR法檢測(cè)HEL,A549細(xì)胞中mRNA表達(dá)量
        2.4.5 Western blot方法檢測(cè)HEL,A549細(xì)胞中蛋白表達(dá)量
    2.5 討論
第3章 NOLC1過(guò)表達(dá)及干擾表達(dá)對(duì)HEL和A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響
    3.1 實(shí)驗(yàn)方案
    3.2 材料
        3.2.1 細(xì)胞株、載體、細(xì)菌菌株
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 溶液配制(見(jiàn)附錄A)
        3.2.4 主要儀器及耗材(見(jiàn)附錄B)
    3.3 方法
        3.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖
        3.3.2 Annexin V-APC/PI雙染法定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        3.3.3 線粒體膜電位(JC-1)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        3.3.4 qRT-PCR和western blot檢測(cè)細(xì)胞通路凋亡因子mRNA表達(dá)量的變化
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖
        3.4.2 Annexin V-APC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        3.4.3 線粒體膜電位(JC-1)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        3.4.4 NOLC1過(guò)表達(dá)對(duì)兩種細(xì)胞凋亡因子mRNA和蛋白表達(dá)量的影響
    3.5 討論
第4章 結(jié)論與展望
    4.1 結(jié)論
    4.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄A 主要儀器與耗材一覽表
附錄B 主要儀器與耗材一覽表
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及參加科研情況



本文編號(hào)：3869662