CRISPR/Cas9技術(shù)是近年發(fā)展起來的快速基因編輯技術(shù)。通過該技術(shù)已對多種生物的基因組進行了編輯。由此產(chǎn)生的基因編輯動物的建系與鑒定是隨之而來較為繁瑣的工作。單導(dǎo)向RNA(single-guide RNA,sgRNA)靶序列的設(shè)計和確定不僅影響后續(xù)靶向基因組的效率,還可作為優(yōu)化鑒定、篩選方法的參考。本研究在選取sgRNA靶序列時,不僅依據(jù)軟件的評分,還分析了sgRNA靶序列是否含有酶切位點,以便對后續(xù)純合子/雜合子進行鑒定。結(jié)果顯示,以特異引物擴增的野生型小鼠Chrm3基因片段可被限制性內(nèi)切酶BanⅡ切為兩個片段;而純合子小鼠"丟失"該酶切位點,其PCR產(chǎn)物不能被切開;雜合子小鼠PCR產(chǎn)物被不完全切開,凝膠電泳結(jié)果可見三條帶。本研究結(jié)果提示該策略可有效簡化基因編輯動物建系鑒定工作,提高鑒定效率及改善陽性動物辨識效果。

【文章頁數(shù)】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1. 1 靶序列的選擇
    1. 2 sgRNA及Cas9 mRNA的獲得
    1. 3 T7EN1 酶切鑒定實驗
    1. 4 顯微操作F0 代鑒定與繁殖
    1. 5 Ban Ⅱ酶切實驗
2 結(jié)果
    2. 1 Chrm3 基因gRNA的設(shè)計
    2. 2 sgRNA的細胞學(xué)驗證
    2. 3 顯微注射與F0 小鼠鑒定
    2. 4 Chrm3 基因編輯后編碼產(chǎn)物的預(yù)測
    2. 5 純合子與雜合子鑒定
    2. 6 Chrm3 基因編輯小鼠體型較小
3 討論



本文編號：3869804