CRISPR/Cas9技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的快速基因編輯技術(shù)。通過(guò)該技術(shù)已對(duì)多種生物的基因組進(jìn)行了編輯。由此產(chǎn)生的基因編輯動(dòng)物的建系與鑒定是隨之而來(lái)較為繁瑣的工作。單導(dǎo)向RNA(single-guide RNA,sgRNA)靶序列的設(shè)計(jì)和確定不僅影響后續(xù)靶向基因組的效率,還可作為優(yōu)化鑒定、篩選方法的參考。本研究在選取sgRNA靶序列時(shí),不僅依據(jù)軟件的評(píng)分,還分析了sgRNA靶序列是否含有酶切位點(diǎn),以便對(duì)后續(xù)純合子/雜合子進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,以特異引物擴(kuò)增的野生型小鼠Chrm3基因片段可被限制性?xún)?nèi)切酶BanⅡ切為兩個(gè)片段;而純合子小鼠"丟失"該酶切位點(diǎn),其PCR產(chǎn)物不能被切開(kāi);雜合子小鼠PCR產(chǎn)物被不完全切開(kāi),凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)三條帶。本研究結(jié)果提示該策略可有效簡(jiǎn)化基因編輯動(dòng)物建系鑒定工作,提高鑒定效率及改善陽(yáng)性動(dòng)物辨識(shí)效果。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1. 1 靶序列的選擇
    1. 2 sgRNA及Cas9 mRNA的獲得
    1. 3 T7EN1 酶切鑒定實(shí)驗(yàn)
    1. 4 顯微操作F0 代鑒定與繁殖
    1. 5 Ban Ⅱ酶切實(shí)驗(yàn)
2 結(jié)果
    2. 1 Chrm3 基因gRNA的設(shè)計(jì)
    2. 2 sgRNA的細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證
    2. 3 顯微注射與F0 小鼠鑒定
    2. 4 Chrm3 基因編輯后編碼產(chǎn)物的預(yù)測(cè)
    2. 5 純合子與雜合子鑒定
    2. 6 Chrm3 基因編輯小鼠體型較小
3 討論



本文編號(hào)：3869804