發(fā)布時(shí)間：2024-09-17 17:04

　　豬繁殖與呼吸綜合征嚴(yán)重危害著世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。每年用于防控該病的疫苗投入,更是數(shù)額巨大。目前,PRRS疫苗多采用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn),增殖的病毒滴度直接影響疫苗的有效性和生產(chǎn)成本。而Marc-145細(xì)胞存在繁殖病毒滴度低的問題。TBK1基因是宿主抗病毒天然免疫信號(hào)通路的重要樞紐,對(duì)于細(xì)胞干擾素的產(chǎn)生具有重要影響。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TBK1基因敲除的Marc-145細(xì)胞株,以期提升病毒的滴度。首先,本研究針對(duì)TBK1基因多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的同源區(qū)設(shè)計(jì)了2對(duì)sgRNA,以pSpCas9(BB)-2A-puro(PX459)質(zhì)粒為載體,將退火形成雙鏈的sgRNA與BbsI酶切線性化的PX459質(zhì)粒相連接,成功構(gòu)建了PX459+sgRNA重組質(zhì)粒。使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至生長狀態(tài)良好的Marc-145細(xì)胞中,通過嘌呤霉素篩選,獲得了多克隆細(xì)胞。再將多克隆細(xì)胞經(jīng)有限稀釋后,培養(yǎng)至96孔細(xì)胞板重,5d后每天在顯微鏡下觀察,挑選出單克隆細(xì)胞。經(jīng)一輪Touchdown PCR鑒定、二輪Touchdown PCR擴(kuò)增送測(cè)序鑒定。結(jié)果共篩選出了兩株TBK1基因敲除...

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖３?ＰＸ４５９＋ｓｇＲＮＡ單克隆菌落鑒定電泳圖??Ｆｉｇ．?３：?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｍａｐ?ｏｆ?ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ?ｃｏｌｏｎｉｅｓ?ｏｆ?ＰＸ４５９＋ｓｇＲＮＡ．??

帶是９１５３ｂｐ、下邊條帶２２ｂｐ太弱未??清晰顯示），２：陰性對(duì)照、??Ｎｏｔｅ：?Ｍ：?ＤＬ２０００，?１：?ＰＸ４５９?ｐｌａｓｍｉｄ?ａｆｔｅｒ?＾．ｖｌ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?（Ｔｈｅ?ｕｐｐｅｒ?ｂａｎｄ?ｉｓ?９１５３?ｂｐ．?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｌｏｗｅｒ?ｓｔｒｉｐ?....

圖５二輪Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ鑒定結(jié)果??Ｆｉｇ．?４：?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｓｅｃｏｎｄ?ｓｔｅｐ?Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ??—－??

?河南農(nóng)、丨ｋ大學(xué)２０１９?ｙ研究１：碩ｈ學(xué)位論文???陽性的單克隆細(xì)胞，有待做進(jìn)？步鑒定。??１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０?２１?２２?２３?２４?Ｍ??�。�?＜Ｃ?ｊ?＿ｃ??丨：?丨，．?ｒ：：．｜??....

圖６?２－２－１８細(xì)胞鑒定序列圖??Ｆｉｇ．?６?Ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?２－２－１８?ｃｅｌｌｓ??

ｐｌｅ?ｓｃｒｅｅｎｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｆｉｒｓｔ?ｓｔｅｐ．??３．４細(xì)胞基因測(cè)序結(jié)果??一．輪Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ擴(kuò)增出的條帶，切膠１１１］收）Ｈ＇、送金唯智公司測(cè)印，將測(cè)得的序列??結(jié)果與ＮＣＢＩ公布的ＴＢＫ１基因該位置的序列進(jìn)行比，結(jié)果顯示：２－２－１８細(xì)胞?＇....

圖７?１－３－Ａ細(xì)胞鑒定序列圖??Ｆｉｇ．?７?Ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?１－３－Ａ?ｃｅｌｌｓ??

?ｓｃｒｅｅｎｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｆｉｒｓｔ?ｓｔｅｐ．??３．４細(xì)胞基因測(cè)序結(jié)果??一．輪Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ擴(kuò)增出的條帶，切膠１１１］收）Ｈ＇、送金唯智公司測(cè)印，將測(cè)得的序列??結(jié)果與ＮＣＢＩ公布的ＴＢＫ１基因該位置的序列進(jìn)行比，結(jié)果顯示：２－２－１８細(xì)胞?＇條染色....

本文編號(hào)：4005765