豬繁殖與呼吸綜合征嚴重危害著世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。每年用于防控該病的疫苗投入,更是數額巨大。目前,PRRS疫苗多采用Marc-145細胞進行生產,增殖的病毒滴度直接影響疫苗的有效性和生產成本。而Marc-145細胞存在繁殖病毒滴度低的問題。TBK1基因是宿主抗病毒天然免疫信號通路的重要樞紐,對于細胞干擾素的產生具有重要影響。本研究利用CRISPR/Cas9技術構建TBK1基因敲除的Marc-145細胞株,以期提升病毒的滴度。首先,本研究針對TBK1基因多個轉錄本的同源區(qū)設計了2對sgRNA,以pSpCas9(BB)-2A-puro(PX459)質粒為載體,將退火形成雙鏈的sgRNA與BbsI酶切線性化的PX459質粒相連接,成功構建了PX459+sgRNA重組質粒。使用脂質體2000轉染試劑將重組質粒轉染至生長狀態(tài)良好的Marc-145細胞中,通過嘌呤霉素篩選,獲得了多克隆細胞。再將多克隆細胞經有限稀釋后,培養(yǎng)至96孔細胞板重,5d后每天在顯微鏡下觀察,挑選出單克隆細胞。經一輪Touchdown PCR鑒定、二輪Touchdown PCR擴增送測序鑒定。結果共篩選出了兩株TBK1基因敲除...

【文章頁數】：70 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３?ＰＸ４５９＋ｓｇＲＮＡ單克隆菌落鑒定電泳圖??Ｆｉｇ．?３：?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｍａｐ?ｏｆ?ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ?ｃｏｌｏｎｉｅｓ?ｏｆ?ＰＸ４５９＋ｓｇＲＮＡ．??

帶是９１５３ｂｐ、下邊條帶２２ｂｐ太弱未??清晰顯示），２：陰性對照、??Ｎｏｔｅ：?Ｍ：?ＤＬ２０００，?１：?ＰＸ４５９?ｐｌａｓｍｉｄ?ａｆｔｅｒ?＾．ｖｌ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?（Ｔｈｅ?ｕｐｐｅｒ?ｂａｎｄ?ｉｓ?９１５３?ｂｐ．?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｌｏｗｅｒ?ｓｔｒｉｐ?....

圖５二輪Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ鑒定結果??Ｆｉｇ．?４：?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｓｅｃｏｎｄ?ｓｔｅｐ?Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ??—－??

?河南農、丨ｋ大學２０１９?ｙ研究１：碩ｈ學位論文???陽性的單克隆細胞，有待做進？步鑒定。??１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０?２１?２２?２３?２４?Ｍ??�。�?＜Ｃ?ｊ?＿ｃ??丨：?丨，．?ｒ：：．｜??....

圖６?２－２－１８細胞鑒定序列圖??Ｆｉｇ．?６?Ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?２－２－１８?ｃｅｌｌｓ??

ｐｌｅ?ｓｃｒｅｅｎｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｆｉｒｓｔ?ｓｔｅｐ．??３．４細胞基因測序結果??一．輪Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ?ＰＣＲ擴增出的條帶，切膠１１１］收）Ｈ＇、送金唯智公司測印，將測得的序列??結果與ＮＣＢＩ公布的ＴＢＫ１基因該位置的序列進行比，結果顯示：２－２－１８細胞?＇....

圖７?１－３－Ａ細胞鑒定序列圖??Ｆｉｇ．?７?Ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?１－３－Ａ?ｃｅｌｌｓ??

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本文編號：4005765