植物轉(zhuǎn)基因工程是作物遺傳改良的重要手段與策略之一,啟動子的靈活應(yīng)用可以為外源基因的高效、特異性表達(dá)提供有效工具。人們利用不同類型的啟動子驅(qū)動下游目的基因的表達(dá),達(dá)到高效、穩(wěn)定表達(dá)的目的。本研究以蓖麻油酸合成關(guān)鍵基因RCPZDAT1-2基因啟動子為研究對象,探究RcPDAT1-2的表達(dá)調(diào)控機制,以通蓖5號蓖麻品種為材料,分析RcPDAT1-2基因,克隆RcPDAT1-2啟動子全長和缺失序列,通過擬南芥轉(zhuǎn)化驗證功能,分析RcPDAT1-2啟動子活性。實驗結(jié)果如下:通過生物信息學(xué)分析RcPDAT1-2基因,結(jié)果表明:RcPDAT1-2基因共編碼660個氨基酸,所編碼的蛋白質(zhì)無信號肽,為非分泌蛋白,存在跨膜結(jié)構(gòu)域,含有2個LCAT結(jié)構(gòu)域。RcPDAT1-2基因啟動子順式作用元件預(yù)測分析顯示,啟動子序列包含除了核心元件TATA-box和CAAT-box,還含有多個光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、逆境脅迫誘導(dǎo)響應(yīng)元件以及MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點等;RcPDA T1-2啟動子全長的活性驗證實驗結(jié)果表明:成功克隆并構(gòu)建RcPDAT1-2基因啟動子全長表達(dá)載體pCAMBIA1303-PDAT1-2(1),轉(zhuǎn)化...

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 蓖麻簡介
    2 蓖麻油酸合成代謝途徑及關(guān)鍵酶研究進(jìn)展
        2.1 蓖麻油酸合成代謝途徑研究進(jìn)展
        2.2 蓖麻油酸合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶研究進(jìn)展
            2.2.1 FAH12基因研究進(jìn)展
            2.2.2 LPCAT基因研究進(jìn)展
            2.2.3 PDCT基因研究進(jìn)展
            2.2.4 PLA2基因研究進(jìn)展
        2.3 RcPDAT1-2基因研究進(jìn)展
    3 植物啟動子的研究進(jìn)展
        3.1 植物啟動子概述
        3.2 植物啟動子類型
            3.2.1 組成型啟動子
            3.2.2 組織特異性啟動子
            3.2.3 誘導(dǎo)型啟動子
        3.3 植物啟動子功能驗證研究進(jìn)展
        3.4 蓖麻啟動子研究進(jìn)展
    4 本研究的目的意義
第二章 蓖麻RcPDAT1-2基因啟動子全長克隆及活性驗證
    1 實驗材料
        1.1 植物材料
        1.2 菌株與載體
        1.3 實驗試劑
        1.4 培養(yǎng)基及試劑配制
        1.5 實驗儀器
    2 實驗方法
        2.1 蓖麻RcPDAT1-2基因及啟動子生物信息學(xué)分析
        2.2 克隆RcPDAT1-2基因啟動子全長序列
            2.2.1 提取蓖麻基因組DNA
            2.2.2 擴增RcPDAT1-2基因啟動子全長序列
            2.2.3 擴增片段回收
            2.2.4 RcPDAT1-2啟動子全長片段與克隆載體連接
            2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
            2.2.6 克隆載體的驗證
        2.3 構(gòu)建RcPDAT1-2基因全長啟動子表達(dá)載體
            2.3.1 pCAMBIA1303載體質(zhì)粒提取
            2.3.2 pCAMBIA1303和pMD18T-PDAT1-2 (1)質(zhì)粒的雙酶切和膠回收
            2.3.3 RcPDAT1-2啟動子全長序列與pCAMBIA1303表達(dá)載體連接
            2.3.4 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
            2.3.5 表達(dá)載體的驗證
            2.3.6 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
            2.3.7 農(nóng)桿菌菌液鑒定
        2.4 RcPDAT1-2基因全長啟動子活性驗證
    3 結(jié)果與分析
        3.1 蓖麻RcPDAT1-2基因及啟動子生物信息學(xué)分析
            3.1.1 RcPLAT1-2基因生物信息學(xué)分析
            3.1.2 RcPDAT1-2啟動子全長生物信息學(xué)分析
        3.2 克隆RcPDAT1-2基因啟動子全長序列
            3.2.1 蓖麻基因組DNA提取
            3.2.2 擴增RcPDAT1-2啟動子全長序列
            3.2.3 構(gòu)建pMD18T-PDAT1-2(1)克隆載體并鑒定
        3.3 RcPDAT1-2基因啟動子全長表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.3.1 pCAMBIA1303載體質(zhì)粒提取結(jié)果
            3.3.2 pCAMBIA1303和pMD18T-PDAT1-2 (1)雙酶切
            3.3.3 pCAMBIA1303-PDAT1-2 (1)表達(dá)載體構(gòu)建及驗證
            3.3.4 pCAMBIA1303-PDAT1-2 (1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        3.4 RcPDAT1-2基因啟動子全長活性驗證
    4 小結(jié)
第三章 RcPDAT1-2啟動子遺傳轉(zhuǎn)化及主要作用元件功能驗證
    1 實驗材料
        1.1 植物材料
        1.2 實驗試劑及配制
    2 實驗方法
        2.1 RcPDAT1-2缺失啟動子的克隆
            2.1.1 克隆RcPDAT1-2缺失啟動子的引物設(shè)計
            2.1.2 RcPDAT1-2缺失啟動子序列擴增
            2.1.3 構(gòu)建RcPDAT1-2缺失啟動子的克隆載體
        2.2 構(gòu)建RcPDAT1-2基因缺失啟動子表達(dá)載體
        2.3 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
            2.3.1 擬南芥植株的種植及培養(yǎng)
            2.3.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化
            2.3.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選
            2.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定
            2.3.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色分析
        2.4 RcPDAT1-2啟動子主要順式作用元件功能驗證
            2.4.1 干旱響應(yīng)元件功能驗證
            2.4.2 低溫響應(yīng)元件功能驗證
    3 結(jié)果與分析
        3.1 RcPDAT1-2缺失啟動子的克隆
            3.1.1 擴增RcPDAT1-2缺失啟動子序列
            3.1.2 RcPDAT1-2缺失啟動子克隆載體的構(gòu)建及鑒定
        3.2 構(gòu)建RcPDA T1-2缺失啟動子表達(dá)載體
            3.2.1 RcPDAT1-2缺失啟動子表達(dá)載體的鑒定
            3.2.2 RcPDAT1-2缺失啟動子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并鑒定
        3.3 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
        3.4 RcPDAT1-2啟動子主要順式作用元件功能驗證
            3.4.1 干旱響應(yīng)元件的功能驗證
            3.4.2 低溫響應(yīng)元件的功能驗證
    4 小結(jié)
第四章 討論與結(jié)論
    1 討論
        1.1 RcPDAT1-2基因生物信息學(xué)分析
        1.2 RcPDAT1-2啟動子順式作用元件
        1.3 啟動子的功能驗證
    2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介
附錄



本文編號：3831996