小麥葉銹菌屬于專化性非常強(qiáng)的活體營養(yǎng)型真菌。在小麥與葉銹菌互作的不親和組合中,寄主細(xì)胞通過過敏性反應(yīng)(hypersensitive reaction,HR)的方式抵抗葉銹菌的侵染。NB-LRR類抗性蛋白是一種重要的R蛋白,根據(jù)N-端保守結(jié)構(gòu)域的不同可以分為TIR-NB-LRR和CC-NB-LRR兩類,近年來,關(guān)于CC-NB-LRR類蛋白在植物抗病方面的報(bào)道越來越多。實(shí)驗(yàn)室前期選用小麥近等基因系TcLr26與其輪回親本Thatcher(Tc)分別與葉銹菌生理小種260組成不親和(有HR)及親和組合(無HR),進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。本研究通過分析該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選到一個(gè)CC-NB-LRR類基因家族的新成員,并且深入探討了該基因在小麥抵抗葉銹菌侵染的HR誘發(fā)中的作用機(jī)制。所得主要結(jié)果如下:1.通過分析小麥與葉銹菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選得到一個(gè)CC-NB-LRR類基因家族新成員,發(fā)現(xiàn)該基因在親和組合中的表達(dá)幾乎為0,而在不親和組合中組成型表達(dá),推測該基因可能與不親和組合中寄主HR的發(fā)生相關(guān),因此將其命名為TaNRH(NB-LRR gene required for HR)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TaNR...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮寫表
1 引言
    1.1 過敏性反應(yīng)是小麥抵抗葉銹菌侵染的重要防衛(wèi)反應(yīng)
    1.2 NB-LRR類 R蛋白在植物免疫中的作用
        1.2.1 NB-LRR類蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.2.2 NB-LRR類蛋白的作用機(jī)制
    1.3 本試驗(yàn)研究內(nèi)容及意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 供試材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 供試儀器設(shè)備
        2.1.4 培養(yǎng)基的配制
    2.2 試驗(yàn)中的引物序列
    2.3 試驗(yàn)方法
        2.3.1 PCR擴(kuò)增TaNRH基因并獲得CDS全長
        2.3.2 TaNRH基因編碼蛋白特征和系統(tǒng)進(jìn)化分析
        2.3.3 小麥與葉銹菌互作過程中TaNRH基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析
        2.3.4 TaNRH的亞細(xì)胞定位檢測
        2.3.5 利用VIGS技術(shù)探究TaNRH基因功能
        2.3.6 RNAi載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.3.7 超表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.3.8 利用酵母雙雜交檢測蛋白互作
        2.3.9 利用雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)檢測蛋白互作
3 結(jié)果與分析
    3.1 TaNRH基因的篩選
    3.2 CL61.contig-13 編碼一個(gè)CC-NB-LRR類蛋白家族的新成員
    3.3 TaNRH在小麥與葉銹菌不親和互作中為組成型表達(dá)
    3.4 TaNRH定位于細(xì)胞質(zhì)中
        3.4.1 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建
        3.4.2 亞細(xì)胞定位觀察
    3.5 利用VIGS技術(shù)沉默TaNRH后 HR的發(fā)生被明顯減慢
        3.5.1 VIGS載體構(gòu)建
        3.5.2 酶切線性化及體外轉(zhuǎn)錄
        3.5.3 BSMV轉(zhuǎn)染病毒及沉默效率檢測
        3.5.4 沉默目的基因后對(duì)HR及葉銹菌發(fā)育的影響
    3.6 利用RNAi技術(shù)沉默TaNRH后 HR的發(fā)生也被明顯減慢
        3.6.1 RNAi載體構(gòu)建
        3.6.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的幼穗遺傳轉(zhuǎn)化
        3.6.3 RNAi陽性植株的篩選
        3.6.4 RNAi陽性植株沉默效率檢測
        3.6.5 沉默目的基因后對(duì)HR及葉銹菌發(fā)育的影響
    3.7 超表達(dá)TaNRH可誘發(fā)HR
        3.7.1 超表達(dá)載體構(gòu)建
        3.7.2 超表達(dá)陽性植株的篩選
        3.7.3 超表達(dá)性植株中TaNRH表達(dá)量檢測
        3.7.4 TaNRH基因超表達(dá)對(duì)HR及葉銹菌發(fā)育的影響
    3.8 TaNRH自身不發(fā)生相互作用
        3.8.1 利用酵母雙雜交技術(shù)檢測互作
        3.8.2 利用Bi FC技術(shù)檢測互作
    3.9 TaNRH和 TaRanGAP2 之間能發(fā)生相互作用
        3.9.1 利用酵母雙雜交技術(shù)檢測互作
        3.9.2 利用Bi FC技術(shù)檢測互作
4 討論
    4.1 TaNRH基因在小麥抵御葉銹菌侵染過程中發(fā)揮重要作用
    4.2 TaNRH可能來自于黑麥
    4.3 TaNRH作用機(jī)制初探
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
作者簡歷
致謝



本文編號(hào)：3811743