近年來(lái),隨著抗生素在牲畜養(yǎng)殖和臨床治療中的大量使用,微生物的耐藥問(wèn)題逐漸受到了世界范圍內(nèi)食品安全和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的廣泛關(guān)注,特別是碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的出現(xiàn),直接導(dǎo)致了人們?cè)诿鎸?duì)多重耐藥菌株時(shí)出現(xiàn)了“無(wú)藥可用”的尷尬境地。在這樣一種嚴(yán)峻的背景下,多肽類抗生素多粘菌素開(kāi)始受到越來(lái)越多的關(guān)注,多粘菌素對(duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌具有殺菌和抑菌作用,特別是針對(duì)越來(lái)越頻繁出現(xiàn)的碳青霉烯類多重耐藥菌株。但是從2016年開(kāi)始由質(zhì)粒介導(dǎo)多粘菌素耐藥基因mcr-1及其同源基因不斷的被報(bào)道出來(lái),使得多粘菌素這一防線受到嚴(yán)重威脅。因此,對(duì)mcr-1陽(yáng)性菌株的耐藥性和mcr-1及相關(guān)家族基因耐藥機(jī)制的研究,對(duì)于多粘菌素耐藥細(xì)菌的防控具有十分重要的意義。本論文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究:mcr-1陽(yáng)性耐藥菌株的篩選及其耐藥性分析;建立針對(duì)5個(gè)mcr家族基因的多重PCR檢測(cè)方法,并且對(duì)該方法的特異性、敏感性進(jìn)行驗(yàn)證;mcr-5基因相關(guān)工程菌株構(gòu)建和其耐藥機(jī)制研究。本論文的主要研究結(jié)果如下:(1)mcr-1基因陽(yáng)性大腸桿菌篩選及其耐藥性分析。從來(lái)自巴基斯坦費(fèi)薩拉巴德區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)肉雞糞便中分離出8株多粘菌素耐藥菌株,經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)...

【文章頁(yè)數(shù)】：99 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 研究背景
    1.1 食源性病原菌簡(jiǎn)介
    1.2 多粘菌素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用
    1.3 多粘菌素的抗菌機(jī)制
    1.4 多粘菌素耐藥機(jī)制的研究現(xiàn)狀
        1.4.1 脂多糖的修飾作用
        1.4.2 多粘菌素的外排泵機(jī)制
        1.4.3 生物膜機(jī)制
    1.5 質(zhì)粒介導(dǎo)的多粘菌素耐藥基因mcr的研究現(xiàn)狀
        1.5.1 mcr-1基因的研究現(xiàn)狀
        1.5.2 mcr家族基因的研究現(xiàn)狀
    1.6 研究目的與意義
2 mcr-1基因陽(yáng)性大腸桿菌篩選及其耐藥性分析
    2.1 前言
    2.2 材料與設(shè)備
        2.2.1 試驗(yàn)材料
        2.2.2 試劑與藥品
        2.2.3 培養(yǎng)基及緩沖液的配置
        2.2.4 儀器與設(shè)備
    2.3 試驗(yàn)方法
        2.3.1 樣品采集及菌株分離
        2.3.2 耐藥菌株的生化及分子鑒定
        2.3.3 耐藥菌株的多粘菌素耐藥水平檢測(cè)
        2.3.4 耐藥菌株的mcr-1基因及質(zhì)粒多樣性檢測(cè)
        2.3.5 耐藥菌株MLST分型檢測(cè)
        2.3.6 耐藥菌株P(guān)K105基因組檢測(cè)及序列組裝
        2.3.7 耐藥菌株P(guān)K105的脂質(zhì)A提取純化及MALDI-TOF質(zhì)譜分析
        2.3.8 耐藥菌株對(duì)其他抗生素耐藥水平的初步檢測(cè)
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 耐藥菌株的鑒定結(jié)果
        2.4.2 耐藥菌株對(duì)多粘菌素的耐藥性
        2.4.3 耐藥菌株的mcr-1基因鑒定及mcr-1質(zhì)粒載體多樣性
        2.4.4 mcr-1陽(yáng)性菌株的MLST分型及其流行性
        2.4.5 mcr-1陽(yáng)性菌株P(guān)K105的質(zhì)�；蚪M圖譜
        2.4.6 mcr-1陽(yáng)性菌株P(guān)K105脂質(zhì)A的化學(xué)修飾
        2.4.7 mcr-1陽(yáng)性菌株的廣譜耐藥性
    2.5 小結(jié)
3 mcr家族基因的多重PCR檢測(cè)方法的建立
    3.1 前言
    3.2 材料與設(shè)備
        3.2.1 試驗(yàn)材料
        3.2.2 試劑與藥品
        3.2.3 培養(yǎng)基及緩沖液的配置
        3.2.4 儀器與設(shè)備
    3.3 試驗(yàn)方法
        3.3.1 引物設(shè)計(jì)
        3.3.2 DNA模板制備
        3.3.3 多重PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)
        3.3.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序
        3.3.5 多重PCR反應(yīng)體系特異性及敏感性檢測(cè)
        3.3.6 野生型菌株mcr基因的檢測(cè)
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 多重PCR產(chǎn)物序列鑒定結(jié)果
        3.4.2 多重PCR反應(yīng)體系的特異性及敏感性
        3.4.3 多重PCR反應(yīng)體系對(duì)野生菌株檢測(cè)的有效性
    3.5 小結(jié)
4 多粘菌素耐藥基因mcr-5的耐藥機(jī)理研究
    4.1 前言
    4.2 材料與設(shè)備
        4.2.1 試驗(yàn)材料
        4.2.2 試劑與藥品
        4.2.3 培養(yǎng)基及緩沖液的配置
        4.2.4 儀器與設(shè)備
    4.3 試驗(yàn)方法
        4.3.1 mcr-5耐藥功能菌株與蛋白表達(dá)菌株的克隆與構(gòu)建
        4.3.2 MCR-5 的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        4.3.3 mcr-5功能位點(diǎn)突變菌株構(gòu)建及耐藥功能驗(yàn)證
        4.3.4 MCR-5與MCR家族蛋白功能區(qū)域互換菌株構(gòu)建及其耐藥功能驗(yàn)證
        4.3.5 磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶MCR-5的蛋白表達(dá)、純化及鑒定
        4.3.6 磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶MCR-5的體外酶活反應(yīng)
        4.3.7 mcr-5功能菌株活性氧的激光共聚焦顯微鏡觀察及化學(xué)拯救試驗(yàn)
        4.3.8 mcr-5的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)菌株生長(zhǎng)狀態(tài)的影響檢測(cè)
        4.3.9 不同mcr家族基因的MG1655菌株多粘菌素最小抑菌濃度檢測(cè)
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 mcr-5耐藥功能菌株與蛋白表達(dá)菌株
        4.4.2 MCR-5 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果
        4.4.3 mcr-5功能位點(diǎn)突變菌株的耐藥功能分析
        4.4.4 mcr-5與其他mcr家族基因蛋白功能區(qū)域互換菌株的耐藥功能分析
        4.4.5 磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶MCR-5的體外純化與蛋白鑒定結(jié)果
        4.4.6 磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶MCR-5的體外酶活催化
        4.4.7 由活性氧介導(dǎo)的多粘菌素殺菌途徑
        4.4.8 mcr-5耐藥基因的表達(dá)對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
        4.4.9 不同mcr家族基因的多粘菌素耐藥性
    4.5 小結(jié)
5 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄



本文編號(hào)：3800326