洋蔥(Allium cepa L.)在分類學(xué)上屬于天門冬目石蒜科蔥亞科蔥屬(APGIII)蔬菜作物,廣泛栽培于世界各地。因其基因組巨大(15,290 Mbp/C),分子生物學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究相對(duì)薄弱,主要集中在育性、顏色相關(guān)基因的分子標(biāo)記上,而關(guān)于洋蔥功能基因的研究甚少。果膠甲酯酶[pectin methylesterase,PME]是一類催化果膠復(fù)合物中甲酯化的D-半乳糖醛酸單元去甲酯化的一類細(xì)胞壁蛋白,根據(jù)其保守的結(jié)構(gòu)域該酶組成了一個(gè)巨大的基因家族,在植物不同的生長發(fā)育階段及其不同的生理過程中,通過作用于細(xì)胞壁而發(fā)揮作用。已有的研究發(fā)現(xiàn),果膠甲酯酶參與了多種生理過程,如果實(shí)成熟、器官脫落、小孢子發(fā)育和花粉管伸長、種子萌發(fā)、抗病性、形成層細(xì)胞分化等。本試驗(yàn)在研究洋蔥育性相關(guān)基因差異表達(dá)的過程中,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大小約為350 bp的差異表達(dá)片段始終只在可育材料中出現(xiàn),克隆了其編碼序列。蛋白質(zhì)序列比對(duì)顯示,該基因表達(dá)的蛋白具有果膠甲酯酶結(jié)構(gòu)域,屬于果膠甲酯酶超家族成員。本研究以洋蔥育性恢復(fù)系12-10(S,MsMs)為研究材料,利用基因克隆、序列分析、原核表達(dá)、生物活性分析及基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化洋蔥...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
符號(hào)說明
中文摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 果膠甲酯酶研究進(jìn)展
        1.1.1 果膠甲酯酶的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 果膠甲酯酶的結(jié)構(gòu)與分類
        1.1.3 果膠甲酯酶的作用機(jī)制
        1.1.4 果膠甲酯酶與植物花粉發(fā)育
    1.2 果膠甲酯酶抑制劑（PMEI）
    1.3 果膠甲酯酶的原核表達(dá)與活性分析
    1.4 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究
        1.4.1 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究意義
        1.4.2 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究方法
    1.5 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 載體與質(zhì)粒
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 儀器設(shè)備
        2.1.6 PCR引物的合成
    2.2 方法
        2.2.1 洋蔥總DNA的提取
        2.2.2 洋蔥總RNA的提取
        2.2.3 電泳檢測
        2.2.4 膠回收與PCR產(chǎn)物純化
        2.2.5 PCR產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化及藍(lán)白板篩選
        2.2.6 質(zhì)粒DNA提取
        2.2.7 測序與序列分析
        2.2.8 洋蔥AcPME基因的克隆
            2.2.8.1 cDNA第一條鏈的合成
            2.2.8.2 cDNA末端擴(kuò)增（3ˊ和 5ˊRACE）
            2.2.8.3 AcPME基因全長DNA和m RNA的獲得
        2.2.9 洋蔥AcPME/AcPMEI基因的原核表達(dá)
            2.2.9.1 PME、PMEI和PMEI-PME片段的擴(kuò)增
            2.2.9.2 基于pGEX4T-1 和pET24a系列的原核表達(dá)載體及工程菌的構(gòu)建
            2.2.9.3 基于pGEX4T-1 和pET24a系列重組質(zhì)粒的蛋白質(zhì)表達(dá)初探
            2.2.9.4 SDS-PAGE電泳檢測
            2.2.9.5 pGEX4T1PME/pET24a-PMEI蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
            2.2.9.6 pGEX4T1PME/pET24a-PMEI蛋白質(zhì)誘導(dǎo)大量表達(dá)
            2.2.9.7 pGEX4T1PME蛋白純化
            2.2.9.8 pET24a-PMEI蛋白純化
        2.2.10 生物活性分析
        2.2.11 洋蔥AcPME蛋白亞細(xì)胞定位
            2.2.11.1 煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)
            2.2.11.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖細(xì)胞定位
            2.2.11.3 洋蔥基因槍瞬時(shí)表達(dá)
            2.2.11.4 熒光觀察
3 結(jié)果與分析
    3.1 洋蔥總DNA和RNA提取結(jié)果
    3.2 洋蔥ACPME基因的克隆
        3.2.1 洋蔥AcPME基因 3ˊ、5ˊRACE及全長DNA和cDNA的擴(kuò)增
        3.2.2 AcPME基因的序列分析
        3.2.3 AcPME蛋白同源比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化
        3.2.4 AcPME蛋白進(jìn)化樹分析及三維結(jié)構(gòu)圖
    3.3 洋蔥ACPME/ACPMEI基因的原核表達(dá)
        3.3.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建
        3.3.2 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
            3.3.2.1 目的蛋白的小量表達(dá)
            3.3.2.2 目的蛋白存在形式
        3.3.3 目的蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
            3.3.3.1 pGEX4T1PME蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
            3.3.3.2 pET 24a-PMEI蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
        3.3.4 目的蛋白純化
            3.3.4.1 pGEX4T1PME蛋白純化
            3.3.4.2 pET 24a-PMEI蛋白純化
        3.3.5 生物活性分析
    3.4 洋蔥ACPME蛋白亞細(xì)胞定位
        3.4.1 煙草葉片注射瞬時(shí)表達(dá)
            3.4.1.1 亞細(xì)胞定位載體的獲得與驗(yàn)證
            3.4.1.2 AcPME基因在煙草中的亞細(xì)胞定位
        3.4.2 洋蔥AcPME蛋白在擬南芥中的定位
            3.4.2.1 擬南芥的轉(zhuǎn)化與篩選
            3.4.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株P(guān)CR鑒定及定位
        3.4.3 洋蔥AcPME蛋白在洋蔥表皮中的定位
            3.4.3.1 洋蔥表皮瞬時(shí)定位載體的獲得與驗(yàn)證
            3.4.3.2 AcPME在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位
4 討論
    4.1 ACPME基因的分類
    4.2 ACPME和ACPMEI的原核表達(dá)系統(tǒng)
    4.3 ACPME基因與洋蔥育性
    4.4 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化及蛋白純化
    4.5 ACPME蛋白亞細(xì)胞定位
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表論文情況



本文編號(hào)：3799838