本文關(guān)鍵詞：利用Redundant Exclusion PCR方法鑒定、克隆Bt新型殺蟲基因，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)對農(nóng)業(yè)害蟲具有特異性的殺蟲活性,是目前害蟲生物防治中最有效的微生物殺蟲劑之一。因此,對Bt菌株中的基因資源鑒定克隆具有重要的意義。為了解決鑒定克隆Bt菌株基因資源傳統(tǒng)研究方法中的速度慢,效率低下的問題,本研究建立了redundant exclusion PCR(RE-PCR)方法,該方法是在PCR同一反應(yīng)體系中同時加入通用引物與特異性引物,以基因組池為模板進行新基因的克隆。在RE-RCR過程中,通用引物可擴增目標基因,特異引物可抑制非靶標冗余基因擴增,以提高新基因的發(fā)掘效率。本研究利用2000株Bt野生菌株基因組構(gòu)建了Bt基因組池,對Bt基因組池中的cry8及cry9類新基因進行鑒定克隆。在Bt基因組池中含有許多已知的殺蟲基因,為了排除非靶標冗余基因?qū)π禄蚩寺〉母蓴_,首先使用通用引物對Bt基因組池中的cry8及cry9類基因分布進行評估,結(jié)果發(fā)現(xiàn),構(gòu)建的基因文庫中已知基因比例占95%以上,其中以cry9Ea、cry9Da基因比例較高,新基因cry8-like(accession:KU143733)克隆比例為4.5%;進一步設(shè)計cry9Ea/b和cry9Da基因特異引物RE9Ea/b_F和RE9Da_F,利用redundant exclusion PCR方法構(gòu)建的基因文庫中未檢測到cry9Da及cry9Eb基因,cry9Ea基因的克隆比例下降到7%,非靶標基因的克隆比例明顯降低,新增了三種已知基因(cry8Ab-like、cry8Ea、cry8Fa)的酶切帶型,新基因cry8-like的克隆比例提高到42.5%,證明該方法能夠有效的抑制冗余基因的擴增,顯著提高稀有新基因的克隆效率。新基因cry8-like與Cry8Ab相似性為79%,將該基因與cry8Ea基因的C-端序列融合并克隆到p STK載體上,轉(zhuǎn)化到無晶體突變菌株HD73-中,獲得重組菌株HD8。掃描電子顯微鏡觀察及SDS-PAGE分析表明:重組菌株能產(chǎn)生球形晶體,并表達130 k Da左右的目的蛋白,經(jīng)胰凝乳蛋白酶消化后可獲得60 k Da左右的蛋白。測定消化后Hycry8蛋白對大猿葉甲及HD8孢晶混合物對銅綠麗金龜、大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜幼蟲的生物活性顯示,HD8孢晶混合物的芽胞含量在1012 CFU/g·土?xí)r對銅綠麗金龜幼蟲具有一定的殺蟲活性,校正死亡率為44%。綜上所述,本研究建立的RE-PCR可高通量快速、高效的對Bt菌株中的基因資源進行鑒定及克隆,有效的提高了新基因的鑒定及克隆效率,對進一步殺蟲基因鑒定與克隆研究有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：蘇云金芽胞桿菌 基因組池 redundant exclusion PCR 基因克隆 生物活性
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;S476
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文獻綜述10-26
• 1.1 蘇云金芽胞桿菌概述10-11
• 1.2 Bt毒素的命名與分類11-12
• 1.3 殺蟲晶體蛋白及其作用機理12-17
• 1.3.1 Cry毒素12-16
• 1.3.2 Cyt毒素16-17
• 1.4 蘇云金芽胞桿菌的應(yīng)用17-18
• 1.4.1 Bt生物殺蟲劑17-18
• 1.4.2 Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物18
• 1.5 Bt殺蟲基因鑒定方法18-23
• 1.5.1 多重PCR19
• 1.5.2 Exclusive PCR19-20
• 1.5.3 PCR-Restriction fragment length polymorphism20-21
• 1.5.4 PCR-High resolution melting21-22
• 1.5.5 PCR-High throughput sequencing22-23
• 1.5.6 宏基因組-PCR23
• 1.6 研究目的及意義23-26
• 第二章 Redundant Exclusion PCR方法的建立及新基因克隆26-46
• 2.1 實驗材料26
• 2.2 實驗方法26-38
• 2.2.1 PCR通用引物設(shè)計26-29
• 2.2.2 Bt基因組池的構(gòu)建29-30
• 2.2.3 Bt基因組池中cry8及cry9類基因鑒定30-33
• 2.2.4 Redundant Exclusion引物設(shè)計33-37
• 2.2.5 Redundant Exclusion引物評估37-38
• 2.2.6 Redundant Exclusion PCR38
• 2.2.7 Redundant Exclusion PCR產(chǎn)物中cry8和cry9類基因型鑒定38
• 2.2.8 新基因序列分析38
• 2.3 結(jié)果38-44
• 2.3.1 Bt基因組池的構(gòu)建38-39
• 2.3.2 Bt基因組池中cry8及cry9類基因鑒定39-42
• 2.3.3 Redundant Exclusion引物評估42-43
• 2.3.4 Redundant Exclusion PCR43-44
• 2.3.5 新基因序列分析44
• 2.4 小結(jié)44-46
• 第三章 cry8-like基因表達及活性分析46-58
• 3.1 實驗材料46-47
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒46
• 3.1.2 供試昆蟲46-47
• 3.2 實驗方法47-52
• 3.2.1 新基因在Bt無晶體突變株中的表達47-51
• 3.2.2 Hycry8蛋白消化51
• 3.2.3 蛋白二級質(zhì)譜鑒定51
• 3.2.4 生物活性測定51-52
• 3.3 結(jié)果52-57
• 3.3.1 cry8-like基因在Bt無晶體突變菌株中的表達52-54
• 3.3.2 二級蛋白質(zhì)譜鑒定54-55
• 3.3.3 生物活性分析55-57
• 3.4 小結(jié)57-58
• 第四章 討論58-60
• 第五章 結(jié)論60-62
• 參考文獻62-72
• 致謝72-74
• 附錄74-78
• 作者簡歷78

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳桂花;束長龍;李穎;宋福平;郭媛媛;李國勛;張杰;;基于聚合酶鏈式反應(yīng)-高通量測序(PCR-HTS)聯(lián)用的cry2A基因鑒定方法[J];中國生物防治學(xué)報;2014年05期

2 劉旭光,宋福平,文思遠,王升啟,黃大f ,張杰;蘇云金芽孢桿菌cry基因芯片檢測方法的研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2004年07期

3 喻子牛;孫明;劉子鐸;戴經(jīng)元;陳亞華;喻凌;羅曦霞;;蘇云金芽孢桿菌的分類及生物活性蛋白基因[J];中國生物防治;1996年02期

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本文編號：379119