本文關(guān)鍵詞：奶牛乳房炎大腸桿菌lps基因亞單位疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乳腺炎是由物理因素、化學(xué)因素和生物因素等引起的乳腺實(shí)質(zhì)性炎癥。奶牛乳腺炎的致病原在自然環(huán)境中廣泛存在,包括細(xì)菌性和非細(xì)菌性病原體,如:支原體、真菌、酵母和衣原體等。據(jù)報(bào)道,大腸桿菌是一種條件性致病菌,是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一。近年來,大腸桿菌引發(fā)的奶牛乳腺炎多有報(bào)道,針對大腸桿菌性乳腺炎的研究也日益增多。大腸桿菌攜帶大量的毒力因子和耐藥性基因。脂多糖是大腸桿菌細(xì)胞壁的重要組成部分,包括類脂A、核心多糖和特異性多糖,是革蘭氏陰性菌最重要的毒力因子。鑒于此,本研究從實(shí)驗(yàn)室保存的野生型大腸桿菌中克隆出與核心多糖抗原合成相關(guān)的基因—lps基因。在T4 DNA連接酶的誘導(dǎo)下,構(gòu)建pcDNA3.1-His-lps重組真核表達(dá)載體。采用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)的方法,將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)。通過熒光定量檢測lps基因在mRNA水平的表達(dá)情況,并通過Western blot(WB)檢測蛋白水平的表達(dá)情況。為了檢驗(yàn)lps基因表達(dá)蛋白的免疫原性,將純化過的脂多糖蛋白通過皮下注射和滴鼻的方式免疫BALB/C小鼠。14d為一個(gè)免疫周期,三免之后的第10d,采取小鼠的血液、呼吸道粘液和肺臟研磨液,選擇大腸桿菌強(qiáng)毒株攻毒免疫小鼠,檢測LPS對小鼠的免疫保護(hù)情況。采取小鼠的血液、呼吸道粘液和肺臟研磨液,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清、呼吸道粘液和肺臟研磨液中IgG抗體和sIgA抗體的效價(jià);通過間接ELISA檢測血清、呼吸道粘液和肺臟研磨液中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ細(xì)胞因子的表達(dá)水平。結(jié)果如下:1.從野生型大腸桿菌中克隆出1282bp基因片段,成功構(gòu)建出pcDNA3.1-lps真核表達(dá)載體。2.成功將pcDNA3.1-lps真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細(xì)胞,經(jīng)過新霉素G418篩選得到陽性細(xì)胞株。提取陽性細(xì)胞株的總蛋白,經(jīng)Western blot鑒定,在42KDa出現(xiàn)一條特異性條帶,與預(yù)測蛋白大小一致。3.經(jīng)ELISA鑒定,脂多糖蛋白免疫小鼠的血清中IgG的效價(jià)高達(dá)1:12800,皮下注射組和滴鼻組之間無明顯差異(P0.05),質(zhì)粒免疫組的效價(jià)為1:3200。SIgA的抗體效價(jià)在蛋白免疫組高達(dá)1:6400,不同蛋白量免疫組織間差異不顯著(P0.05),質(zhì)粒免疫組的效價(jià)為1:1600。IL-2和IFN-γ的表達(dá)水平在蛋白免疫組與質(zhì)粒免疫組差異極顯著(P0.01),與PBS對照組的差異極顯著(P0.01);IL-4的表達(dá)水平在LPS蛋白免疫組與質(zhì)粒免疫組差異性顯著(P0.05),與PBS對照組的差異極顯著(P0.01)。IL-6的表達(dá)水平在各組之間無明顯差異(P0.05)。4動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明,蛋白免疫組的保護(hù)率為60%-70%,質(zhì)粒免疫組的保護(hù)率為20%-30%,PBS對照組的保護(hù)率為0。本研究成功獲得奶牛乳房炎大腸桿菌lps基因亞單位疫苗,其具有較好的免疫保護(hù)率,這為奶牛乳房炎的預(yù)防和治療奠定理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：奶牛 乳房炎 大腸桿菌 lps 重組載體 免疫 抗體 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.23
【目錄】：

• 縮略詞對照表4-6
• 摘要6-8
• Summary8-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-26
• 1 奶牛乳房炎概述12
• 2 乳房炎的病因?qū)W12-13
• 2.1 病原因素13
• 2.2 環(huán)境因素13
• 2.3 自身因素13
• 3 乳房炎的免疫機(jī)制13-15
• 3.1 先天性免疫機(jī)制13-14
• 3.2 體液免疫機(jī)制14
• 3.3 細(xì)胞免疫機(jī)制14-15
• 4 大腸桿菌乳房炎概述15-19
• 4.1 大腸桿菌的生物學(xué)特性15
• 4.2 大腸桿菌的致病性15-17
• 4.3 大腸桿菌乳房炎的危害17-19
• 5 大腸桿菌乳房炎的預(yù)防19-20
• 5.1 加強(qiáng)管理19
• 5.2 規(guī)范擠奶操作19
• 5.3 加強(qiáng)對乳房炎的檢測19-20
• 5.4 改善農(nóng)場的環(huán)境衛(wèi)生20
• 5.5 疫苗預(yù)防20
• 6 大腸桿菌乳房炎的治療20-23
• 6.1 抗生素治療20-21
• 6.2 噬菌體療法21
• 6.3 疫苗21-22
• 6.4 納米粒子22
• 6.5 細(xì)胞因子22
• 6.6 抗菌劑22-23
• 7 大腸桿菌性乳房炎疫苗的研究進(jìn)展23-24
• 7.1 滅活疫苗23
• 7.2 大腸桿菌苗23-24
• 7.3 DNA疫苗24
• 7.4 基因缺失疫苗24
• 7.5 亞單位疫苗24
• 8 大腸桿菌脂多糖24-26
• 第二章 大腸桿菌pc DNA3.1-His-lps重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定26-35
• 1 材料與方法26-31
• 1.1 試驗(yàn)材料26-27
• 1.2 試驗(yàn)方法27-31
• 2 結(jié)果31-33
• 2.1 大腸桿菌lps的克隆與鑒定31-32
• 2.2 重組載體T-easy-lps的鑒定32
• 2.3 重組載體的鑒定32-33
• 3 討論33-35
• 第三章 重組真核表達(dá)載體pc DNA3.1-His-lps在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定35-46
• 1 材料與方法35-41
• 1.1 試驗(yàn)材料35-36
• 1.2 試驗(yàn)方法36-41
• 2 結(jié)果41-45
• 2.1 轉(zhuǎn)染41-42
• 2.2 反轉(zhuǎn)錄鑒定42-43
• 2.3 熒光定量檢測在m RNA水平的表達(dá)情況43-44
• 2.4 Western blot檢測在蛋白水平的表達(dá)情況44-45
• 3 討論45-46
• 第四章 Lps基因亞單位疫苗的免疫原性研究46-59
• 1 材料與方法46-51
• 1.1 試驗(yàn)材料46-47
• 1.2 試驗(yàn)方法47-51
• 2 結(jié)果51-57
• 2.1 純化蛋白的鑒定51
• 2.2 皮下免疫組血清中Ig G效價(jià)水平的檢測51-52
• 2.3 滴鼻免疫氣管與肺臟沖洗液中SIg A與Ig G抗體效價(jià)水平檢測52-53
• 2.4 皮下免疫與滴鼻免疫Ig G抗體效價(jià)的比較53-54
• 2.5 各免疫組小鼠血清中細(xì)胞因子水平的檢測54-56
• 2.6 攻毒保護(hù)結(jié)果56-57
• 3 討論57-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-70
• 致謝70-71
• 作者簡介71-72
• 導(dǎo)師簡介72-73

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本文編號(hào)：381589