發(fā)布時間：2023-03-05 00:42

　　偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)作為豬的一種重要病原體,在全球廣泛傳播。長期以來,PRV受到獸醫(yī)學家、病毒學家以及神經(jīng)生物學家的廣泛關注及研究,目前對PRV的研究已經(jīng)為皰疹病毒發(fā)病機制提供了相當全面的參考依據(jù)。2018年中國上海報道了首例人類感染PRV的情況,引起相關研究學者們強烈重視。單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)UL12基因編碼一種堿性核酸酶(Alkaline nuclease,AN),AN由皰疹病毒科基因組中共同保守序列編碼。有研究報道HSV UL12誘導的mtDNA應激反應引發(fā)先天性抗病毒反應,本研究以PRV UL12基因為研究對象,對其相關功能做出初步探究。主要內(nèi)容為:1.pEGFP-N1-UL12重組質粒的構建與PRV UL12蛋白生物信息學分析參考GenBank中PRV UL12基因序列設計特異性引物,以PRV-XJ株為模板,PCR擴增UL12目的基因并成功構建pEGFP-N1-UL12重組質粒;通過生物信息學方法針對PRV UL12氨基酸的序列進行分析預測。2.PRV UL12真核表達及其細胞定位將pEGFP-...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞對照表
第一章 文獻綜述
    1 偽狂犬病毒研究進展
        1.1 病原學
        1.2 病毒分子生物學特征
        1.3 病毒復制過程
            1.3.1 病毒穿入
            1.3.2 核內(nèi)反應
            1.3.3 病毒釋放
        1.4 潛伏與神經(jīng)侵染
        1.5 病毒凋亡基因抑制
        1.6 UL12 基因研究進展
    2 細胞凋亡
        2.1 形態(tài)和生化特征
        2.2 細胞凋亡信號通路
            2.2.1 外源性細胞凋亡途徑
            2.2.2 內(nèi)源性細胞凋亡途徑
            2.2.3 其他凋亡途徑
    3 研究目的及意義
第二章 PRV UL12 基因的克隆及生物信息學分析
    1.實驗材料
        1.1 病毒、菌株與細胞
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 偽狂犬病毒UL12 基因的擴增
            2.1.1 特異性引物設計
            2.1.2 PRV增殖
            2.1.3 PRV DNA抽提
            2.1.4 PCR擴增
            2.1.5 目的片段純化回收
        2.2 構建PEGFP-N1-UL12 重組質粒
            2.2.1 目的片段與pEGFP-N1 真核表達載體雙酶切
            2.2.2 雙酶切目的片段回收
            2.2.3 目的片段連接至pEGFP-N1 真核表達載體
            2.2.4 制備DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞
            2.2.5 連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α
            2.2.6 重組質粒鑒定
        2.3 PRV UL12 生物信息學分析
            2.3.1 PRV UL12 蛋白理化性質分析
            2.3.2 PRV UL12 蛋白跨膜區(qū)域結構預測
            2.3.3 PRV UL12 蛋白信號肽分析
            2.3.4 PRV UL12 蛋白相關位點預測
            2.3.5 PRV UL12 蛋白二級結構預測
    3 結果與分析
        3.1 PRV UL12 基因擴增
        3.2 PEGFP-N1-UL12 重組質粒的構建及鑒定
        3.3 PRV UL12 蛋白生物信息分析
            3.3.1 PRV UL12 蛋白理化性質分析
            3.3.2 PRV UL12 蛋白跨膜區(qū)域結構預測
            3.3.3 PRV UL12 蛋白信號肽分析
            3.3.4 PRV UL12 蛋白磷酸化位點預測
            3.3.5 PRV UL12 蛋白N端糖基化位點預測
            3.3.6 PRV UL12 蛋白O-糖基化位點預測
            3.3.7 PRV UL12 蛋白二級結構預測
    4 討論
    5 小結
第三章 PRV UL12 基因的真核表達及細胞定位
    1 實驗材料
        1.1 主要試劑
        1.2 細胞
        1.3 主要儀器
        1.4 主要溶液配置
    2 方法
        2.1 PEGFP-N1-UL12 去內(nèi)毒素質粒抽提
        2.2 PEGFP-N1-UL12 重組質粒轉染BHK21 細胞
        2.3 樣品制備
        2.4 WESTERN BLOT檢測
        2.5 UL12-GFP融合蛋白細胞定位
    3 結果
        3.1 GFP綠色熒光蛋白表達
        3.2 WESTERN BLOT檢測結果
        3.3 PRV UL12在BHK21 細胞中的定位
    4 討論
    5 小結
第四章 PRV UL12 基因在BHK21 細胞凋亡中的作用及其對PRV增殖的影響
    1 實驗材料
        1.1 主要試劑
        1.2 病毒
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 綠色熒光蛋白表達差異分析
        2.2 流式細胞術檢測BHK21 細胞凋亡率
        2.3 QPCR測定CASPASE-3 凋亡因子表達情況
            2.3.1 引物設計
            2.3.2 細胞樣品總RNA抽提
            2.3.3 RT-PCR反應
            2.3.4 qPCR測定caspase-3 凋亡因子
        2.4 體外表達PRV UL12對PRV增殖的影響
    3 結果
        3.1 GFP綠色熒光蛋白表達
        3.2 流式細胞術檢測結果
        3.3 CASPASE-3 凋亡因子表達情況
        3.4 體外表達PRV UL12對PRV增殖的影響
    4 討論
    5 小結
全文總結
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3755342